缺氮條件對柵藻油脂積累與光合作用的影響

劉金麗 , 王俊峰, 劉天中, 高莉麗

(1. 中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院, 山東 青島 266003; 2. 中國科學(xué)院 青島生物能源與過程研究所,中國科學(xué)院 生物燃料重點實驗室, 山東 青島 266101)

近年來, 可再生能源的研發(fā)在全球范圍形成持續(xù)熱潮。利用微藻生產(chǎn)生物柴油具有不與人爭糧、不與糧爭地、不與糧爭水、副產(chǎn)物價值高等優(yōu)勢, 是重要的液體燃料替代形式[1-2]。在適宜條件下, 產(chǎn)油微藻通常處于營養(yǎng)生長狀態(tài), 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量較低,且多為極性脂(polar lipid), 如磷脂(phospholipid); 而在脅迫條件下, 細(xì)胞內(nèi)很快積累大量中性脂(neutral lipid), 如甘油三脂(triacylglycerol, TAG)。這期間細(xì)胞所經(jīng)歷的生理生化變化是近年來研究的熱點。如Li等[3-4]發(fā)現(xiàn)抑制萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的淀粉合成途徑會提高油脂含量, 表明在衣藻中脂肪代謝與糖代謝密切相關(guān)。Chen等[5]發(fā)現(xiàn)微擬球藻(Nannochloropsis)的脂肪酸組成與初始細(xì)胞接種量密切相關(guān), 接種細(xì)胞濃度較低時中性脂含量高, 而接種濃度較高時極性脂含量較高, 表明微藻脂肪酸組分可能與細(xì)胞所處光環(huán)境有關(guān)。Cakmak等[6]發(fā)現(xiàn)缺氮或缺硫都可以提高衣藻的TAG含量。Recht等[7]發(fā)現(xiàn)缺氮條件下雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)和微擬球藻均會大量積累油脂, 但它們的糖-脂比例存在不同的變化模式。

柵藻(Scenedesmus dimorphus)屬綠藻門(Chlorophyta)、綠球藻目(Chlorococcales), 是一種常見的淡水微藻, 廣泛分布于湖泊、池塘、沼澤等靜水生境。柵藻是研究水體環(huán)境、水體污染、光合作用的常用材料。同時, 由于其生長快速、能大量合成油脂, 是典型的產(chǎn)油微藻[8]。柵藻對環(huán)境的適應(yīng)性強(qiáng),耐污染能力強(qiáng)[9], 甚至能在污水、城市生活廢水中生長[10], 這一特性使其在規(guī)?；囵B(yǎng)方面較其他微藻更具優(yōu)勢。有學(xué)者研究了柵藻合成蝦青素過程的色素組成和光合作用的變化[11-13], 但關(guān)于其油脂積累過程的報道還較少。深入了解柵藻的產(chǎn)油過程將有助于推進(jìn)利用柵藻生產(chǎn)微藻柴油的研究和應(yīng)用。本研究利用柵藻(Scenedesmusdimorphus)為實驗材料,考察了缺氮條件下柵藻的油脂含量和組分變化以及光合作用的改變。

1 材料與方法

1.1 藻種與培養(yǎng)基

本實驗所用柵藻(Scenedesmus dimorphus)來自中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所, 所用培養(yǎng)基為 BG11[14]。柵藻油脂誘導(dǎo)過程采用不含硝酸鈉(NaNO3)的缺氮 BG11培養(yǎng)基, 其他組分及含量均不變, 對照組為完全BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 反應(yīng)器與培養(yǎng)方法

本實驗所用反應(yīng)器為玻璃柱式反應(yīng)器, 內(nèi)直徑0.05 m, 柱高0.55 m, 工作體積0.9 L。柱式反應(yīng)器內(nèi)部有一直徑 5 mm的玻璃通氣管?；旌嫌?1.5%CO2(V/V)的壓縮空氣(0.1 MPa)以0.1 vvm的速率通過通氣管從反應(yīng)器底部鼓泡, 從而將藻液攪動并補(bǔ)充碳源。培養(yǎng)過程中連續(xù)照光, 培養(yǎng)柱表面光強(qiáng)100 μmol/(m2·s)。培養(yǎng)溫度25°C, 培養(yǎng)過程中pH維持在7.0～8.0。對照組(完全BG11)和實驗組(缺氮BG11)各培養(yǎng)5支柱子, 測定其中的3支, 記為3個重復(fù)。

1.3 生長測定

用質(zhì)量分析方法測定藻液生物量濃度。將孔徑0.45 μm, 直徑 50 mm的混合纖維素濾膜(上海興亞凈化材料廠, 上海)煮沸3次, 并于105℃熱風(fēng)干燥24 h后稱重。將一定體積的藻液過濾于濾膜上, 并用3倍體積的去離子水沖洗 3次, 以去掉附著在細(xì)胞表面的鹽分, 105 °C熱風(fēng)干燥24 h后再次稱重。根據(jù)兩次質(zhì)量之差計算出藻液生物量濃度。

葉綠素及類胡蘿卜素含量參照甲醇提取葉綠素[15]的方法。測定甲醇提取液在666 nm, 653 nm, 470 nm下的OD值。根據(jù)以下公式分別計算葉綠素a(Chla), 葉綠素b(Chlb), 類胡蘿卜素(Car)的含量:

1.4 電鏡觀察

1.4.1 掃描電鏡(Scanning electron microscopy,SEM)

取少量藻液于1.5 mLEP管中離心(5 000 g, 30 s),去上清, 雙蒸水清洗藻渣3次。加入1 mL的2.5%戊二醛固定2 h, 然后加1.5 mL磷酸緩沖液(pH 7.0)清洗3次, 每次10 min。加1%鋨酸固定1 h。固定完后,依次用10%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%(V/V)乙醇脫水, 每個梯度15 min。再浸入100%乙醇脫水2次, 每次 10 min, 然后浸入 1:1(V/V)的乙醇-叔丁醇混合液中15 min, 再浸入100%叔丁醇中2次, 每次15 min,最后冷凍干燥。用導(dǎo)電膠帶粘于樣品臺, 噴金后觀察SEM圖像。

1.4.2 透射電鏡(Transmission electron microscopy,TEM)

取樣固定步驟同 1.4.1。固定后樣品用磷酸緩沖液(pH 7.0)清洗 2 h, 然后依次用 10%, 30%, 50%,70%, 80%, 90%丙酮脫水, 每個梯度15 min。之后浸入100%丙酮中3次, 每次10 min。然后浸入丙酮與Epon812樹脂混合液(V∶V= 7:3)中5 h, 再浸入丙酮與Epon812樹脂混合液(V∶V= 3:7)中過夜。最后純Epon812樹脂中浸沒5 h并聚合硬化成包埋塊, 超薄切片機(jī)切片, 2%醋酸雙氧鈾染色20 min后觀察TEM圖像。

1.5 油脂含量及組分分析

將藻液離心收集后(5 000g, 30 s), 藻細(xì)胞真空冷凍干燥后研磨成干粉, 依據(jù)有機(jī)溶劑氯仿-甲醇提取方法[16]提取藻細(xì)胞中的總脂并稱重定量。

分析油脂組分及含量用棒狀薄層色譜法(TLC/FID)來測定。將提取的油脂用氯仿溶解, 取1 μL分4～5次點樣在棒狀薄層色譜柱上, 先后在兩種展開劑中展開。展開劑Ⅰ:苯:氯仿:乙酸 = 50:20:0.75 (V/V),展開劑Ⅱ:苯:己烷 = 1:1 (V/V)。將分離開來的脂質(zhì)成分出峰時間與標(biāo)準(zhǔn)樣品相對比, 確定其組成及相對含量。分析過程中的條件控制: 空氣流 2 L/min , 氫氣流0.16 L/min。

1.6 光合放氧速率的測定

使用 Chlorolab-2液相氧電極(Hansatech, 英國)測定柵藻細(xì)胞在不同光強(qiáng)(PFD)下的放氧速率。將藻液離心后(5 000g, 30 s)沉淀用含有50 mmol/L NaHCO3的含氮或無氮BG11重新懸浮, 調(diào)整懸浮液葉綠素濃度至10 mg/L。將1 mL懸浮液加入反應(yīng)杯中, 通入純氮氣1 min趕走溶解氧, 打開光源記錄放氧速率。通過加減遮光片數(shù)量改變?nèi)肷涔鈴?qiáng), 設(shè)置的光強(qiáng)梯度為: 400, 200, 100, 80, 60, 40, 20, 0 μmol/(m2·s)。每個光強(qiáng)測定3次, 每次測定前更換新藻液。根據(jù)葉子飄和李進(jìn)省[17]和 Ye[18]的方法擬合 PFD-放氧速率曲線, 并計算暗呼吸速率(Rd)、最大放氧速率 (Pmax)、光補(bǔ)償點 (LCP)和光飽和點 (LSP)。

1.7 葉綠素?zé)晒獾臏y定

使用Imaging-PAM (Walz, 德國)測定柵藻的最大光化學(xué)效率 (Fv/Fm)和非光化淬滅系數(shù)(Non-photochemical quenching co-efficiency, NPQ)。將藻液過濾與孔徑0.45 μm的混合纖維素濾膜上, 然后置于用含50 mmol/L NaHCO3的含氮或無氮BG11培養(yǎng)基潤濕的濾紙上。將濾紙連同濾膜一起置于熒光儀CCD攝像頭下暗適應(yīng)15 min。打開測量光, 測定初始熒光 (F0), 然后加飽和脈沖光 (10 000 μmol/(m2·s)),測定最大熒光 (Fm), 之后打開活化光 (100 μmol/(m2·s))。待熒光值穩(wěn)定后再加一次飽和閃光, 測定實際最大熒光 (Fm’)。按照如下公式計算相關(guān)參數(shù)[19]:

1.8 統(tǒng)計分析

使用 spss10.0對實驗組與對照組做t檢驗, 當(dāng)P＜0.05時認(rèn)為兩者存在顯著差異。圖中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果

2.1 缺氮處理對柵藻生長的影響

電鏡結(jié)果如圖1所示, 其中(a)～(c)是掃描電鏡結(jié)果, 標(biāo)尺=3 μm; (d)～(f)是透射電鏡結(jié)果, 標(biāo)尺=1 μm;(a)和(d)是接種初始時結(jié)果; (b)和(e)是對照組(高氮)培養(yǎng)10 d的結(jié)果; (c)和(f)是缺氮培養(yǎng)10 d的結(jié)果; (g)是(d)圖框定區(qū)域的放大, 標(biāo)尺=0.5 μm。SG表示淀粉粒; TL表示類囊體; LB表示脂肪體。實驗開始時柵藻細(xì)胞呈梭形, 并以四連體形式存在(圖1a), 細(xì)胞內(nèi)可見淀粉粒被類囊體膜包裹, 無脂肪體(圖1d, g)。缺氮處理 10 d后, 柵藻細(xì)胞四連體解體, 直徑明顯增大(圖1c), 細(xì)胞壁明顯加厚, 細(xì)胞內(nèi)部大量空間被脂肪滴和淀粉粒填充(圖1f)。高氮條件下(對照組)生長10 d后細(xì)胞形態(tài)與初始時變化不大(圖1b), 但細(xì)胞壁明顯加厚, 淀粉粒明顯增多(圖1e)。

圖1 缺氮處理對柵藻(Scenedesmus dimorphus)細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 The effect of nitrogen starvation on the morphology and structure of the Scenedesmus dimorphus

缺氮處理的生物量積累與對照組在前 4 d差別不大(P＞0.05), 4 d后缺氮處理生物量積累速率減慢并顯著低于對照組(P＜0.05)。對照組10 d內(nèi)生物量增加到(5.8 ± 0.03)g/L, 而缺氮處理組為(4.1 ± 0.04)g/L(圖 2)。

圖2 缺氮處理對柵藻(Scenedesmus dimorphus)生長的影響Fig.2 The effect of nitrogen starvation on the biomass accumulation of the Scenedesmus dimorphus

隨著培養(yǎng)時間延長, 對照組和處理組的單位干重葉綠素和類胡蘿卜素含量都降低, 但缺氮處理降低的更快(圖3a, 圖3b)。與對照組相比, 缺氮處理組的類胡蘿卜素/葉綠素含量比值在培養(yǎng)過程中逐漸升高并一直顯著高于對照組(P＜0.05; 圖3c)。對照組與處理組的葉綠素 a/葉綠素 b含量比值差別不大并一直維持在2.2～3.1之間(圖3d)。

圖3 缺氮處理對柵藻(Scenedesmus dimorphus)葉綠素和類胡蘿卜素積累的影響Fig.3 The effect of nitrogen starvation on the accumulation of chlorophyll and carotenoid in the Scenedesmus dimorphus

2.2 缺氮處理對柵藻油脂積累和油脂組分的影響

未經(jīng)缺氮處理的柵藻細(xì)胞總脂含量占干重的(22.4 ± 0.6)%, 其中總脂的(92.8 ± 1.6)%為磷脂(PL),中性脂(TAG)只占(4.6 ± 1.2)%(圖4)。缺氮處理后柵藻總脂含量逐漸升高, 13 d后總脂含量升高到(36.3 ± 0.7)%(圖 4), 顯著高于(P＜0.05)對照組的(30.1 ± 0.7)%; 其中 TAG 含量升高到(68.3 ± 2.5)%(圖4), 顯著高于(P＜0.05)對照組的(37.0 ± 0.1)%; PL 含量降低到(26.8 ± 2.0)%(圖 4), 顯著低于(P＜0.05)對照組的(55.7 ± 2.4)%。

圖4 缺氮處理對柵藻(Scenedesmus dimorphus)總脂含量和總脂組分的影響Fig.4 The effect of nitrogen starvation on the total lipid content and lipid components of the Scenedesmus dimorphus

2.3 缺氮處理對柵藻光合作用的影響

缺氮處理使柵藻的暗呼吸速率(Rd)和光補(bǔ)償點(LCP)迅速升高, 而對照組在實驗過程中維持穩(wěn)定(圖5a, d)。隨著培養(yǎng)時間的延長, 缺氮處理組和對照組的最大放氧速率(Pmax)都逐漸降低, 至實驗結(jié)束時分別為(37.6 ± 3.6)μmol O2/ mgchl·h 和(75.4 ± 6.4)μmolO2/ (mgchl·h)(圖 5b)。實驗開始時, 柵藻的光飽和點(LSP)為(198.2 ± 6.8)μmol/(m2·s), 之后實驗組和對照組均降低, 到第 13 天時, 缺氮處理組降低到(94.4 ± 2.1)μmol/(m2·s), 而對照組降低到 (119.7 ±1.6)μmol/(m2·s)(圖 5c)。

培養(yǎng)過程中, 對照組的最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)和非光化學(xué)猝滅系數(shù)(NPQ)基本維持穩(wěn)定。缺氮處理1 d后柵藻Fv/Fm即明顯低于對照組, 但前 4 d內(nèi)Fv/Fm一直維持在較高水平(＞0.6), 之后開始逐漸下降, 到第10 天時已降至0.4 ± 0.01; 而NPQ在前3 d內(nèi)較低且維持穩(wěn)定, 從第 4 天開始逐步升高, 到第10 天時以升高到1.5 ± 0.01, 是初始時的1.8倍(圖6)。

圖5 缺氮處理對柵藻(Scenedesmus dimorphus)光合放氧參數(shù)的影響Fig.5 The effect of nitrogen starvation on the photosynthetic oxygen evolution of the Scenedesmus dimorphus

圖6 缺氮處理對柵藻(Scenedesmus dimorphus)最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)和非光化學(xué)猝滅系數(shù)(NPQ)的影響Fig.6 The effect of nitrogen starvation on the maximum photo-chemical efficiency (Fv/Fm)and non-photochemical quenching co-efficiency (NPQ)of Scenedesmus dimorphus

3 討論

三脂酰甘油(TAG)是優(yōu)質(zhì)的生物能源原料。經(jīng)過酯化反應(yīng), TAG中的脂肪酸鏈可以轉(zhuǎn)化成能完全替代普通柴油的高熱值、低污染的生物柴油, 而剩余的甘油骨架既是重要的工業(yè)原料, 也可以通過進(jìn)一步加氫轉(zhuǎn)化成生物乙醇[20]。本研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)13 d后, 柵藻的總脂含量達(dá)到干重的 36%, 顯著高于油料作物大豆的平均水平[21]。這一值與雨生紅球藻(Haematococcus)的含油量接近[7]而低于微擬球藻(Nannochloropsis)[5]。高含油量, 特別是高中性脂含量是微藻作為生物柴油原料來源的重要優(yōu)勢。目前,關(guān)于微藻脂肪代謝, 特別是脅迫條件下 TAG的積累過程的研究尚不充分[21]。本研究發(fā)現(xiàn)缺氮條件下, 隨著TAG含量的升高, 磷脂含量出現(xiàn)相應(yīng)的下降(圖4),同時細(xì)胞內(nèi)部的膜結(jié)構(gòu)也逐漸減少(圖1f)。據(jù)此推測柵藻細(xì)胞內(nèi)部可能存在將磷脂轉(zhuǎn)化成TAG的機(jī)制。例如, 通過磷脂二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(Phospholipid diacylglycerol acyltransferase, PDAT)的磷脂代謝途徑。在高等植物中PDAT途徑廣泛存在, 而在微藻中只存在于少數(shù)種類[22-23], 而柵藻中尚未見報道。此外,脅迫條件下微藻細(xì)胞碳源的分配問題一直不太清楚。Li等[3-4]發(fā)現(xiàn)抑制衣藻的淀粉代謝會導(dǎo)致油脂積累的增加, 說明淀粉合成和油脂合成會競爭碳源。Recht等[7]發(fā)現(xiàn)對于雨生紅球藻來說在氮缺乏條件下存在由淀粉向 TAG轉(zhuǎn)化的代謝途徑, 而在Nannochloropsis中則不存在這樣的途徑。在本實驗中, 缺氮培養(yǎng) 13 d后的柵藻細(xì)胞中, 除了大量的脂肪體外, 還存在較多的淀粉粒和較厚的細(xì)胞壁(圖1f),這說明柵藻的大量合成TAG的過程對糖代謝的影響較小, 胞外碳源直接流向了能量密度較高的脂肪酸合成途徑。

營養(yǎng)缺乏(特別是氮源缺乏)結(jié)合高光強(qiáng)是誘導(dǎo)微藻合成次生代謝物的常用方法[6-7,24-25]。本研究中,培養(yǎng)用光強(qiáng)為 100 μmol/(m2·s)左右, 這一光強(qiáng)在實驗初期遠(yuǎn)低于 200 μmol/(m2·s)的光飽和點(LSP), 即使在培養(yǎng)后期也僅達(dá)到與LSP接近的水平(圖 5c),所以柵藻細(xì)胞所處的環(huán)境只有缺氮脅迫而沒有強(qiáng)光脅迫。與對照組相比, 缺氮處理的柵藻細(xì)胞最明顯的改變是葉綠素含量降低而呼吸速率升高, 而且這些變化十分迅速, 在處理第 1 天即表現(xiàn)出來(圖3a, 圖5a)。脅迫條件下葉綠素含量快速降低、呼吸速率升高的現(xiàn)象已經(jīng)被廣泛報道[7,11,26], 但多是在強(qiáng)光下(＞300 μmol/(m2·s))或室外(光強(qiáng)＞2 000 μmol/(m2·s)的研究結(jié)果。另外, 許多研究表明在脅迫條件下微藻細(xì)胞內(nèi)的類胡蘿卜素含量升高[6,11-13], 但是本研究中,缺氮脅迫下柵藻細(xì)胞內(nèi)類胡蘿卜素含量實在培養(yǎng)過程中一直在降低(圖3b)。這表明類胡蘿卜素(蝦青素)的合成可能需要強(qiáng)光環(huán)境。葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm是反映光系統(tǒng)II完整性的重要指標(biāo)[27]。通常情況下, 經(jīng)充分暗適應(yīng)的未受脅迫的綠藻Fv/Fm值在 0.7左右,受到脅迫后該值降低。Parkhill等[28]發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)鹽的缺乏對微藻的Fv/Fm值的影響不明顯, 這與本文的結(jié)果不同, 我們發(fā)現(xiàn)缺氮處理 1d后柵藻Fv/Fm即明顯低于對照組。但同時我們也注意到, 在缺氮處理前期柵藻光系統(tǒng)Ⅱ并沒有受到嚴(yán)重?fù)p傷, 4 d之后光系統(tǒng)Ⅱ的損傷逐步加劇, 類似的情況也表現(xiàn)在最大光合放氧速率(圖5b)和NPQ上(圖6b)。如果說強(qiáng)光條件下減少葉綠素含量、增大呼吸速率、提高光系統(tǒng)Ⅱ失活反應(yīng)中心的比例、提高NPQ等改變有助于光合系統(tǒng)減少光能吸收、加快能量耗散, 從而減少過剩激發(fā)能產(chǎn)生的傷害[18], 那么非飽和光下的類似變化如何解釋？我們給出兩種假設(shè): 1)碳同化和氮同化過程是光合作用產(chǎn)生的能量通匯(ATP)和還原力(NADPH)的主要流向[29]。氮源缺乏的時候, ATP和NADPH會相對過剩, 進(jìn)而導(dǎo)致光合電子傳遞鏈激發(fā)能的過度積累, 可能會進(jìn)一步造成光合作用的損傷, 從而需要啟動上述機(jī)制以保護(hù)細(xì)胞。2)上述生理學(xué)變化與光破壞的防御機(jī)制無關(guān), 而是柵藻細(xì)胞為了適應(yīng)缺氮環(huán)境, 將自身代謝模式由先前的營養(yǎng)生長主動轉(zhuǎn)換到次生代謝物積累的結(jié)果, 可能反映了細(xì)胞將暫時無用物質(zhì)(如氮代謝酶系統(tǒng))轉(zhuǎn)化為能量儲存物質(zhì)(如TAG)的過程。

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