仿刺參不同體外標(biāo)記方法效果的比較

孫 璐, 邱天龍, 許 強, 劉 輝, 林承剛, 楊紅生

(1. 中國科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

仿刺參(Apostichopus japonicus)也稱刺參, 屬棘皮動物門(Echinodermata), 海參綱(Holothuroidea),楯手目(Aspidochirotida), 仿刺參科(Stichopodidae),是中國北方海域重要的經(jīng)濟物種[1]。其主要生產(chǎn)方式為工廠化養(yǎng)殖、池塘圍堰養(yǎng)殖、自然海區(qū)底播和野生種群采捕等。仿刺參身體柔軟, 體壁沒有硬質(zhì)部分,且變形和排異能力極強, 是難以實現(xiàn)體外長效標(biāo)記的海洋生物之一。使用體外標(biāo)記技術(shù)可對仿刺參進行種群和個體尺度上的時空行為學(xué)研究、種群動態(tài)研究、良種繁育、高效采捕方法研究[2]。

使用具有編碼的標(biāo)記可為仿刺參個體的行為學(xué)研究提供極大的便利。Uthicke等[3]利用基于擴增片段長度多態(tài)性的DNA指紋技術(shù)對海參進行個體識別,效果良好。然而此類基因技術(shù)標(biāo)記的缺點在于野外實驗時無法直接識別海參個體。Mercier等[4]和Shiell[5]采用在海參表皮刻畫記號的方法進行標(biāo)記,操作性差且記號會隨著海參體壁的自愈而模糊。

Yanagisawa[6]使用了類似的方法, 即用熱金屬絲在海參體壁表面進行烙印, 但是這種方法對海參傷害較大, 易造成死亡, 且烙印隨著體壁生長而變得難以辨認。Harriott[7]、Kirschenbaum 等[8]和 Purcell等[9]先后嘗試了體壁植入T形標(biāo)等方法, 但是植入的標(biāo)記物均被排出或造成海參死亡, 保留率同樣不高。Morgan[10]指出, 標(biāo)記造成的體壁潰爛是標(biāo)記脫落的主要原因, 任何標(biāo)記方法應(yīng)當(dāng)做到的基本原則是 T形標(biāo)完全穿過體壁而不是停留在體壁中, 并且使穿刺造成的傷口盡可能小。在國內(nèi), 趙鵬等[11]已經(jīng)建立了一種使用鈣黃綠素標(biāo)記仿刺參骨片的方法, 該方法尤其適宜于群體研究, 如研究標(biāo)記回捕, 群體遷移規(guī)律等。然而該方法的局限性在于無法區(qū)分不同仿刺參個體, 無法追蹤及定量化研究仿刺參個體在野外環(huán)境下的行為特征。這些研究為探索仿刺參體外標(biāo)記技術(shù)提供了參考, 但以上方法的標(biāo)記無法長期保留, 且不能區(qū)分個體。為突破這一瓶頸, 本實驗進一步研究了在仿刺參身體上添加體外標(biāo)簽的方法,評估了在仿刺參不同部位添加標(biāo)簽后仿刺參的行為反應(yīng), 并篩選出適宜進行仿刺參體外標(biāo)記的方法。

1 材料與方法

體腔植入標(biāo)記物法、體壁半包埋法、棘部及體壁穿刺法、體壁膠粘法所使用的仿刺參均為榮成天鵝湖自然海域采捕的底播養(yǎng)殖健康仿刺參, 體質(zhì)量為100 g左右。石灰環(huán)嵌套法實驗使用工廠化養(yǎng)殖、體質(zhì)量為(10.7±1.5)g的小規(guī)格健康仿刺參和100 g左右的大規(guī)格健康仿刺參。進行實驗前, 將仿刺參轉(zhuǎn)移至實驗場所并進行馴化; 實驗期間, 仿刺參均暫養(yǎng)于室內(nèi)玻璃鋼水槽, 水槽內(nèi)放置石塊以模擬自然環(huán)境,水溫保持在 10℃左右, 以利于部分實驗中仿刺參傷口的愈合并防止感染, 每日換水 1/2, 投喂海泥與藻粉質(zhì)量比1∶1配合飼料。

1.1 體腔植入標(biāo)記物法

本實驗使用模擬標(biāo)記物(pvc管, 1.5 g)對仿刺參進行體內(nèi)填充。實驗個體為10頭體質(zhì)量為100 g左右的健康仿刺參。模擬標(biāo)記物經(jīng)過100℃淡水煮沸消毒后, 從仿刺參背部切口植入仿刺參體腔內(nèi), 切口長度為20 mm, 植入后對切口不做處理, 暫養(yǎng)觀察。

1.2 體壁半包埋法

由于前述體腔植入法直接影響了仿刺參呼吸消化等重要器官的生理活動, 對仿刺參造成了嚴(yán)重的影響, 因而設(shè)計了一種使標(biāo)記物掛在仿刺參身體外的連接頭, 以減少對仿刺參體腔內(nèi)部器官的影響。模擬標(biāo)記物與連接頭成啞鈴形, 連接頭圓盤直徑為 8 mm,底盤厚度 0.8 mm。植入操作同體腔植入標(biāo)記物法,模擬標(biāo)記物經(jīng)過煮沸消毒, 使用時將連接頭的圓盤包埋入仿刺參體壁下, 將模擬標(biāo)記物一側(cè)留在體外, 如圖1。本組實驗使用10頭健康仿刺參, 按上述操作后暫養(yǎng)觀察。

圖1 使用體壁半包埋法標(biāo)記后外觀Fig. 1 Appearance of Apostichopus japonicus with somatic embedding

1.3 棘部及體壁穿刺法

棘是仿刺參特有的突出于體表的器官。通過實驗分別采用聚乙烯塑料線、銀釘、羊腸線對仿刺參棘部及體壁進行穿刺標(biāo)記, 如圖2。每組實驗個體健康仿刺參10頭, 穿刺后于海水中暫養(yǎng)觀察。

圖2 使用穿刺法標(biāo)記后外觀Fig. 2 Appearance of Apostichopus japonicus with spine and somatic piercing

1.4 體壁膠粘法

體壁膠粘法是將標(biāo)記物使用膠水粘附于仿刺參體壁表面。本實驗采用醫(yī)用膠(主要成分α-氰基丙烯酸丁酯)和普通502膠水(主要成分α-氰基丙烯酸乙酯)兩種膠水, 使用大小兩種規(guī)格的模擬標(biāo)記物 A和B(濕質(zhì)量3 g和0.8 g, 分別占實驗仿刺參質(zhì)量3%和0.8%)。選擇健康仿刺參, 使用上述兩種膠將模擬標(biāo)記物粘附于各組仿刺參體壁表面。

1.5 石灰環(huán)嵌套法

圖3 使用石灰環(huán)嵌套法后外觀Fig. 3 Appearance of calcareous ring nesting

仿刺參口咽部有一圈緊密排列的細小石灰質(zhì)骨針, 稱為石灰環(huán)。本方法使用細線從仿刺參口部穿入,經(jīng)過石灰環(huán), 在體前五分之一體長處經(jīng)由體壁穿出,打結(jié)固定, 松緊度使細線恰好接觸體壁外側(cè), 如圖3。本實驗中小規(guī)格組使用重5 g左右仿刺參, 設(shè)3個處理組和1個對照組, 處理組分別使用尼龍線(線徑0.16 mm),聚丙烯線(線徑0.19 mm), 不可吸收手術(shù)縫合線(型號4/0, 線徑約0.150～0.199 mm)進行標(biāo)記, 每個處理設(shè)3個重復(fù), 每個重復(fù)使用 30頭仿刺參。實驗仿刺參養(yǎng)殖于塑料水箱(140 L), 水箱內(nèi)放置石塊, 以模擬自然生長環(huán)境。大規(guī)格組使用重100 g左右仿刺參, 設(shè)1個處理組和1個對照組, 使用尼龍線(線徑0.16 mm)進行標(biāo)記, 設(shè)3個重復(fù), 每個重復(fù)使用30頭仿刺參, 養(yǎng)殖于塑料水箱(400 L)。

2 結(jié)果

2.1 體腔植入標(biāo)記物法

使用此方法植入標(biāo)記物后3 h, 即有50%被排出體外, 42 h后全部排出, 如圖4。

圖4 體腔植入標(biāo)記物后仿刺參排異情況Fig. 4 Rejection of tags with body cavity implantation

2.2 體壁半包埋法

包埋后仿刺參對標(biāo)記物連同連接頭的排異情況相對上一種標(biāo)記方法并不嚴(yán)重, 且排異所需時間較長, 但8 d后排異率仍達到了90%, 如圖5。

圖5 標(biāo)記物半包埋后排異率變化Fig. 5 Rejection of tags with somatic embedding

2.3 棘部及體壁穿刺法

使用穿刺法進行體壁標(biāo)記的標(biāo)記物保留情況好于棘部標(biāo)記, 3種標(biāo)記材料中銀質(zhì)材料保留率最低,見表1。

表1 穿刺法添加標(biāo)記物后的保留率Tab. 1 Retention of tags with spine and somatic piercing

2.4 體壁膠粘法

使用醫(yī)用膠將模擬標(biāo)志物粘貼于仿刺參體壁后12 h, A組全部脫落且創(chuàng)面發(fā)生潰爛; B組模擬標(biāo)志物部分脫落, 48 h后全部脫落, 創(chuàng)面無潰爛。使用502膠水粘貼后12 h, A組全部脫落且創(chuàng)面潰爛; B組12 h后未脫落, 48 h后全部脫落, 創(chuàng)面無潰爛。標(biāo)記后仿刺參運動和攝食行為未受影響。

2.5 石灰環(huán)嵌套法

使用石灰環(huán)嵌套法標(biāo)記小規(guī)格后 48～72 h, 標(biāo)簽脫落數(shù)最多, 此后則較穩(wěn)定, 幾乎沒有標(biāo)簽脫落。各組仿刺參死亡后進行解剖, 發(fā)現(xiàn)標(biāo)簽保留率較高(圖6～圖7)。

然而, 標(biāo)記后各組仿刺參體壁均出現(xiàn)被標(biāo)記線磨傷、潰爛的情況, 其中聚丙烯線和不可吸收手術(shù)縫合線標(biāo)記組仿刺參情況較嚴(yán)重, 在標(biāo)記后72和48 h全部死亡; 尼龍線標(biāo)記組仿刺參體壁潰爛情況較輕,但也在10 d后全部死亡(圖8～圖9)。

大規(guī)模仿刺參標(biāo)記后只發(fā)生輕微潰爛或脫落現(xiàn)象, 僅在標(biāo)記后1、3、4和15 d發(fā)生脫落, 共6個標(biāo)記, 至標(biāo)記后3個月時標(biāo)簽保留率為93.3%。

圖6 石灰環(huán)嵌套法標(biāo)記后每日標(biāo)簽脫落情況Fig. 6 Detachment of tags with calcareous ring nesting

圖7 石灰環(huán)嵌套法10 d后標(biāo)簽保留率Fig. 7 Final retention of tags of calcareous ring nesting

圖8 石灰環(huán)嵌套法標(biāo)記后仿刺參體壁潰爛情況Fig. 8 Somatic fester of Apostichopus japonicus tagged with calcareous ring nesting

3 討論

3.1 影響仿刺參標(biāo)記穩(wěn)定性的生物學(xué)因素

3.1.1 仿刺參的伸縮性

仿刺參的體壁具有極強的伸展和收縮能力, 能夠在肌肉的帶動下緩慢而有力地對身體形狀做出調(diào)整, 甚至達到與正常時的外形差別極大的狀態(tài), 以適應(yīng)周圍環(huán)境或完成各種生命活動。在使用體壁半包埋法的標(biāo)記實驗中, 仿刺參在標(biāo)記后產(chǎn)生了較劇烈的整體體型變化或者局部的體壁變形。在體壁半包埋法實驗中, 標(biāo)記物被穿刺固定于仿刺參體壁, 仿刺參為排出標(biāo)記物, 將標(biāo)記處被穿刺的體壁孔洞再次擴張,使標(biāo)記物脫離后再收縮受損的標(biāo)記處體壁孔洞。這種行為使得在仿刺參體壁的各個位置都難以通過簡單的包埋來完成特異性標(biāo)記。

圖9 石灰環(huán)嵌套法標(biāo)記后仿刺參死亡情況Fig. 9 Death of Apostichopus japonicus tagged with calcareous ring nesting

3.1.2 仿刺參的自溶和再生性

海參具有自溶能力, 在遇到不利的環(huán)境條件時(受傷、敵害等), 自行將部分體壁溶解。而在利用自溶成功度過不利情況后, 受損身體部位又能夠在一段時間后自行修復(fù)并愈合[12,13]。在棘部及體壁穿刺法中, 仿刺參在被標(biāo)記物穿過體壁后產(chǎn)生自溶現(xiàn)象,將標(biāo)記處體壁部分溶解以使標(biāo)記物脫落, 再經(jīng)過一段時間重新愈合此處。以上這些特征對于特異性標(biāo)記方法的開發(fā)無疑是首要面對的難題。在這一點上, 前述幾種標(biāo)記方法均難以長期存留于仿刺參體外, 無法滿足特異性標(biāo)記的基本要求。

3.1.3 仿刺參的排異反應(yīng)

體腔植入標(biāo)記物法、體壁半包埋法和棘部及體壁穿刺法 3種破壞性的標(biāo)記方法均對仿刺參標(biāo)記位置產(chǎn)生較明顯的傷害, 造成標(biāo)記后不同程度的排異現(xiàn)象, 較嚴(yán)重?zé)o法自愈時可導(dǎo)致死亡。在標(biāo)記脫落之前,仿刺參普遍出現(xiàn)活動強度減弱、停止進食或進食減少的情況。

有研究指出金屬銀具有抗菌作用[14], 且多個行業(yè)均有使用各種含銀材料作為抗菌材料的先例[15-16]。因此在嘗試使用棘部及體壁穿刺法進行標(biāo)記時, 銀也成為了研究人員選擇的標(biāo)記材料之一。然而實驗結(jié)果顯示, 仿刺參對銀質(zhì)材料具有極其強烈的排異反應(yīng), 在棘上部和棘基部穿刺的銀線被排出速度均顯著快于聚乙烯和羊腸線兩種材料。前期實驗中各種金屬材料的標(biāo)記效果同樣不令人滿意, 因此推斷仿刺參對于金屬的排異反應(yīng)較強烈。另外, 本實驗中聚乙烯線效果好于羊腸線, 介于兩者線徑相同, 其原因有可能在于材料表面光滑程度的較大差別, 另一個原因則是羊腸線本身屬于異體蛋白質(zhì), 組織反應(yīng)較重。因此在后續(xù)的石灰環(huán)嵌套法實驗中, 研究人員選擇了表面光滑的尼龍線作為標(biāo)記材料之一。

使用體壁膠粘法進行標(biāo)記時發(fā)現(xiàn), 較大質(zhì)量的模擬標(biāo)志物一組使用兩種膠水都會在標(biāo)記處發(fā)生體壁潰爛現(xiàn)象, 小質(zhì)量組則未發(fā)生潰爛, 并且保留時間長于大質(zhì)量組。據(jù)此推斷當(dāng)所需標(biāo)記保存時間不超過24 h時, 可使用合適膠水和質(zhì)量小于仿刺參體質(zhì)量1%的標(biāo)簽, 使用體壁膠粘法進行標(biāo)記。

3.2 標(biāo)記效果與應(yīng)用前景

通過對上述幾種標(biāo)記方法的總結(jié)分析, 研究人員選擇了仿刺參唯一一處無法自行脫出標(biāo)記物的位置——石灰環(huán), 進行標(biāo)記實驗。本實驗中, 聚丙烯線和不可吸收手術(shù)縫合線在標(biāo)記效果的各個指標(biāo)上均顯著差于尼龍線, 表明前兩種材料和質(zhì)地對仿刺參影響較大, 不適宜作為此法中的標(biāo)記用線。相對以上兩種材料, 尼龍線優(yōu)點在于表面質(zhì)地光滑, 標(biāo)記過程中和標(biāo)記后由于仿刺參活動造成的摩擦均較小, 因而對仿刺參傷害也較小。通過觀察和后期的解剖鑒定,使用石灰環(huán)嵌套法進行標(biāo)記, 凡是準(zhǔn)確穿過石灰環(huán)的標(biāo)記, 均沒有脫落, 標(biāo)簽保留率達到可以投入使用的水平。但由于嘗試使用小規(guī)格仿刺參進行標(biāo)記實驗以便為遺傳育種工作提供技術(shù), 所以造成對仿刺參傷害較大。后期使用100 g左右的大規(guī)格仿刺參進行標(biāo)記, 標(biāo)記后第2天即可恢復(fù)攝食活動, 4 d后攝食恢復(fù)正常, 且標(biāo)記 3個月后標(biāo)簽保留率仍達到 93.3%,標(biāo)記效果良好。大規(guī)格仿刺參其石灰環(huán)也較大, 相對于小規(guī)格仿刺參更利于標(biāo)記準(zhǔn)確穿過石灰環(huán), 較高的標(biāo)簽保留率也印證了這一推測。初步認為該方法適宜使用于仿刺參體外標(biāo)記用以進行行為學(xué)等研究,但標(biāo)記后對仿刺參生長情況是否具有影響尚須驗證。

4 結(jié)語

石灰環(huán)嵌套法是一種有廣泛使用潛力的仿刺參體外長效標(biāo)記技術(shù), 其優(yōu)點在于操作方法簡便, 標(biāo)記材料可獲得性較好且成本較低, 標(biāo)記效果良好。使用標(biāo)記線作為載體, 可在其上附加各種標(biāo)簽, 如常規(guī)編號標(biāo)簽、電子標(biāo)簽、聲學(xué)標(biāo)簽等, 為仿刺參的時空行為學(xué)研究、種群動態(tài)研究、良種繁育、高效采捕方法研究等提供重要技術(shù)支撐。

[1]廖玉麟. 中國動物志——海參綱[M]. 北京: 科學(xué)出版社1997: 148-150.

[2]Conand C. Methods of studying growth in holothurians(beche-de-mer), and preliminary results from a beche-de-mer tagging experiment in New Caledonia[J].Fish Newsletter, 1983, 26(3): 31-38.

[3]Uthicke S, Benzie A H. A genetic fingerprint recapture technique for measuring growth in unmarkable invertebrates: negative growth in commercially fished holothurians (Holothuria nobilis)[J]. Marine Ecology Progress Series, 2002, 241: 221-226.

[4]Mercier A, Battaglene S C, Hamel J F. Periodic movement, recruitment and size-related distribution of the sea cucumberHolothuria scabrain Solomon Islands[J]. Hydrobiologia, 2000, 440(1-3): 81-100.

[5]Shiell G R. Effect of invasive tagging on the activity ofHolothuria whitmaei(Echinodermata : Holothuroidea):A suitable mark-recapture method for short-term field studies of holothurian behaviour[J]. Marine and Freshwater Behaviour and Physiology, 2006, 39(2):153-162.

[6]Yanagisawa T. Sea-cucumber ranching in Japan and some suggestions for the South Pacific[C]. Tonga:Aquaculture Workshop, 1995, 387-400.

[7]Harriot V J. The ecology ofHolothurian faunaof Heron Reef and Moreton Bay[D]. Townsville: University of Queensland, 1980.

[8]Kirschenbaum S, Feindel S, Chen Y. A study of tagging methods for the sea cucumber Cucumaria frondosa in the waters off Maine[J]. U.S. National Marine Fisheries Service Fishery Bulletin, 2006, 104: 299-302.

[9]Purcell S W, Blockmans B F, Nash W J. Efficacy of chemical markers and physical tags for large-scale release of an exploited holothurian[J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 2006, 334(2): 283-293.

[10]Morgan A D. Induction of spawning in the sea cucumberHolothuria scabra(Echinodermata: Holothuroidea)[J].Journal of World Aquaculture Society, 2000, 31(2):186-194.

[11]趙鵬, 楊紅生, 王曉宇, 等. 鈣黃綠素標(biāo)記仿刺參的效果及其對仿刺參抗氧化酶活力的影響[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2011, 35(3):372-378.

[12]李霞, 聶竹蘭, 魏杰. 仿刺參體壁表皮再生組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)觀察[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2007, 14(7): 1-6.

[13]聶竹蘭, 李霞. 海參再生的研究[J]. 海洋科學(xué), 2006,30(5):78-82.

[14]張文鉦, 張羽天. 載銀抗菌材料的研究與開發(fā)[J]. 化工新型材料, 1997, 7: 20-22.

[15]王維清, 馮啟明, 董發(fā)勤. 銀系抗菌材料及其研發(fā)應(yīng)用現(xiàn)狀[J]. 應(yīng)用化工, 2004, 33(4): 1-3.

[16]陳炯, 韓春茂, 林小瑋, 等. 納米銀敷料在修復(fù)Ⅱ度燒傷創(chuàng)面的應(yīng)用研究[J]. 中華外科雜志, 2006, 44(1): 50-52.