分子模擬技術(shù)在脂肪酶性質(zhì)及催化機(jī)理研究中的應(yīng)用進(jìn)展

王 哲，王 普，黃 金

（浙江工業(yè)大學(xué)生物制藥研究所，浙江 杭州 310014）

脂肪酶（lipase，EC 3.1.1.3）是一種甘油酯水解酶，屬α/β折疊水解酶類。它廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞中。脂肪酶不僅可在油水兩相界面催化天然底物甘油酯的水解，還可在疏水介質(zhì)中催化酯化、轉(zhuǎn)酯化、酯交換等反應(yīng)。由于脂肪酶具有反應(yīng)活性高、立體選擇性強(qiáng)和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，使其在食品、皮革、造紙、有機(jī)合成、油脂化工、洗滌劑、化妝品、醫(yī)藥以及生物柴油合成等諸多領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，有關(guān)脂肪酶催化機(jī)理研究已逐漸引起人們的關(guān)注。脂肪酶有別于酯酶、蛋白酶等其它α/β折疊水解酶的最顯著特征在于它的催化活性中心部位被一個(gè)或多個(gè)α-螺旋片段遮蓋（稱為“蓋子”結(jié)構(gòu)）。這種特殊結(jié)構(gòu)使得當(dāng)環(huán)境中存在油水兩相界面時(shí)，蓋子結(jié)構(gòu)打開，從而暴露出脂肪酶催化活性中心，發(fā)揮其催化功能（在行使催化功能時(shí)，脂肪酶的催化活性中心三元組中的組氨酸（His）從絲氨酸（Ser）上吸收一個(gè)質(zhì)子，使得Ser親核攻擊羰基上的碳原子，形成特殊的脂肪酶-底物復(fù)合物的四面體過(guò)渡態(tài) TS（tetrahedral transition state）（見圖1）。在整個(gè)過(guò)程中天冬氨酸（Asp）通過(guò)與組氨酸（His）形成氫鍵起到穩(wěn)定組氨酸位置的作用）。

隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)、生物信息學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)等研究領(lǐng)域的快速發(fā)展，利用分子模擬技術(shù)研究脂肪酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，在催化過(guò)程中的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)變化進(jìn)而理解其反應(yīng)機(jī)理和構(gòu)效關(guān)系，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)脂肪酶的理性設(shè)計(jì)與改造已引起眾多學(xué)者濃厚的研究興趣[1-2]。分子模擬技術(shù)的發(fā)展進(jìn)程大致可分為3個(gè)階段：早期的皮秒（ps）級(jí)別的分子動(dòng)力學(xué)模擬；柔性的分子對(duì)接技術(shù)；運(yùn)算時(shí)間更長(zhǎng)的分子動(dòng)力學(xué)模擬以及 QM/MM（quantum mechanics/molecular mechanics，量子力學(xué)/分子力學(xué)）。

1 早期的分子動(dòng)力學(xué)模擬

分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)[3]主要依靠牛頓力學(xué)來(lái)模擬分子體系的運(yùn)動(dòng)，從而獲得生物大分子在已知最低能量構(gòu)象附近一系列合理的空間構(gòu)象。因此，早期關(guān)于脂肪酶分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)主要是用于脂肪酶構(gòu)象變化的研究。Norin等[4]于1994年通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)方法比較了米黑根毛霉脂肪酶（Rhizomucor mieheilipase，RmL）在真空、水溶液和非極性溶液等不同溶劑條件下的構(gòu)象變化，發(fā)現(xiàn)RmL 在非極性有機(jī)溶劑中比水相中的剛性更強(qiáng)，并且依據(jù)在乙酸乙酯溶劑中的動(dòng)力學(xué)模擬，揭示出RmL 蓋子結(jié)構(gòu)的關(guān)閉與打開狀態(tài)。Peters等[5]1996年研究多種溶劑對(duì)RmL結(jié)構(gòu)的影響時(shí)也得出類似的結(jié)論。Zuegg等[6]于1997年運(yùn)用分子動(dòng)力學(xué)模擬方法研究了褶皺假絲酵母脂肪酶（Candida rugosalipase，CrL）和洋蔥假單胞菌脂肪酶（Pseudomonas cepacialipase，PcL）兩種脂肪酶催化水解伯醇酯和仲醇酯的四面體過(guò)渡態(tài)構(gòu)象差異，提出了“大小口袋”規(guī)則（見圖2），并依據(jù)該規(guī)則揭示了脂肪酶催化上述兩種酯水解的對(duì)映體選擇性機(jī)理。由于受到當(dāng)時(shí)計(jì)算機(jī)的運(yùn)算速度所限，整個(gè)分子動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程僅運(yùn)行了15 ps。

2 柔性分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)脂肪酶的對(duì)映體選擇性及催化機(jī)理

分子對(duì)接技術(shù)是通過(guò)幾何匹配、能量匹配和化學(xué)環(huán)境匹配來(lái)尋找復(fù)合物的最優(yōu)狀態(tài)[7]。各種分子對(duì)接方法的計(jì)算體系均存在不同程度的簡(jiǎn)化。根據(jù)簡(jiǎn)化的程度和方式不同，可將分子對(duì)接方法分為剛性對(duì)接、半柔性對(duì)接和全柔性對(duì)接，其中，剛性對(duì)接主要用于蛋白-蛋白對(duì)接。隨著分子對(duì)接技術(shù)的發(fā)展，人們開始運(yùn)用半柔性或全柔性的對(duì)接技術(shù)研究脂肪酶對(duì)底物的對(duì)映體選擇性。Tafi等[8]將全柔性對(duì)接技術(shù)應(yīng)用于定性預(yù)測(cè)脂肪酶水解反應(yīng)的對(duì)映體選擇性研究，通過(guò)分子對(duì)接打分以及復(fù)合物的幾何構(gòu)象是否符合脂肪酶過(guò)渡態(tài)構(gòu)象來(lái)判斷立體選擇性的優(yōu)劣（見圖3）。

柔性分子對(duì)接技術(shù)具有快速預(yù)測(cè)脂肪酶在催化過(guò)程中的立體選擇性的優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于脂肪酶對(duì)底物選擇性的高通量虛擬篩選[9-13]。Tyagi等[9]通過(guò)對(duì)分子對(duì)接打分，預(yù)測(cè)了6種脂肪酶水解12種底物的能力（見表1），但由于僅依據(jù)對(duì)接打分來(lái)進(jìn)行預(yù)測(cè)，其評(píng)價(jià)體系過(guò)于單一且導(dǎo)致預(yù)測(cè)結(jié)果并不理想，需要進(jìn)一步結(jié)合復(fù)合物幾何構(gòu)象等因素綜合判斷對(duì)接結(jié)果。Xu等[10]通過(guò)設(shè)計(jì)南極假絲酵母脂肪酶（Candida antarcticalipase B，CaLB）催化底物四面體過(guò)渡態(tài)的幾何構(gòu)象來(lái)定性預(yù)測(cè)該脂肪酶對(duì)底物的對(duì)映體選擇性。經(jīng)驗(yàn)證，233個(gè)化合物中有 223個(gè)化合物被正確識(shí)別，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率高達(dá)95.7%。分子對(duì)接技術(shù)作為一種簡(jiǎn)單快速的計(jì)算機(jī)模擬手段應(yīng)用于定性預(yù)測(cè)脂肪酶催化立體選擇性的研究已有較多報(bào)道，但其計(jì)算精確度不高，不能全面地闡述脂肪酶的催化機(jī)理。因此分子對(duì)接方法多被用于模擬初始的復(fù)合物構(gòu)象，再結(jié)合運(yùn)用其它手段，如定量構(gòu)效關(guān)系（QSAR）、分子動(dòng)力學(xué)和QM/MM 等方法，進(jìn)一步研究其催化機(jī)理。

3 長(zhǎng)運(yùn)算時(shí)間的分子動(dòng)力學(xué)模擬、QM/MM 方法及QSAR方法

隨著計(jì)算機(jī)運(yùn)算能力的發(fā)展，分子動(dòng)力學(xué)方法由最初只能計(jì)算皮秒（ps）級(jí)別的分子運(yùn)動(dòng)，逐漸發(fā)展到納秒（ns）級(jí)、甚至是微秒（μs）級(jí)。在此期間，人們利用分子動(dòng)力學(xué)方法研究脂肪酶性質(zhì)及催化機(jī)理的報(bào)道逐漸增多，且預(yù)測(cè)結(jié)果也越來(lái)越精準(zhǔn)。

表1 6種脂肪酶水解12種底物的對(duì)接打分

已報(bào)道的將分子動(dòng)力學(xué)應(yīng)用于脂肪酶性質(zhì)和機(jī)理研究涉及以下4個(gè)方面。①在不同溶劑中的脂肪酶構(gòu)象變化。Rahman等[14]研究洋蔥伯克氏細(xì)菌脂肪酶（Burkholderiacepacialipase）在水-辛烷兩相混合溶劑體系中構(gòu)象變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，在水環(huán)境中脂肪酶的“蓋子”結(jié)構(gòu)處于閉合狀態(tài)，而當(dāng)辛烷分子接近“蓋子”時(shí)，脂肪酶的“蓋子”結(jié)構(gòu)打開，且“蓋子”打開的幅度與溫度有關(guān)，溫度越高，打開幅度越大。Wedberg等[15]采用分子動(dòng)力學(xué)方法考察了 5種水-有機(jī)溶劑混合體系對(duì)南極假絲酵母脂肪酶 B（Candida antarcticalipase B）氨基酸殘基柔性的影響，得到了類似的結(jié)論。②不同 pH 值條件下的酶結(jié)構(gòu)變化。James等[16]將褶皺假絲酵母脂肪酶（Candida rugosalipase）分別置于pH值為5.6和7.2的水溶液中，并進(jìn)行了2 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬，結(jié)果表明：中性pH值條件下脂肪酶“蓋子”區(qū)的柔性更強(qiáng)，底物更容易進(jìn)入活性中心區(qū)域，因而反應(yīng)速率更快。③研究脂肪酶與底物間的作用機(jī)制和選擇性機(jī)理[17-20]。Raza等[18]基于分子動(dòng)力學(xué)方法，并通過(guò)計(jì)算南極假絲酵母脂肪酶 B（Candida antarcticalipase B）與底物形成四面體過(guò)渡態(tài)后的結(jié)合自由能，較好地預(yù)測(cè)了其對(duì)映體選擇性。Xu等[19]在研究南極假絲酵母脂肪酶 B與底物的過(guò)渡態(tài)相互作用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了幾種非常規(guī)的復(fù)合物結(jié)合模式（見圖4）。④對(duì)脂肪酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行理性的設(shè)計(jì)和改造[1，21]。Park等[1]基于分子動(dòng)力學(xué)方法比較了南極假絲酵母脂肪酶B經(jīng)定點(diǎn)突變前后在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性，并找到了該脂肪酶中3個(gè)可以提高其在有機(jī)溶劑中穩(wěn)定性的關(guān)鍵殘基。

對(duì)于脂肪酶催化反應(yīng)來(lái)說(shuō)，首先脂肪酶通過(guò)“界面激活”效應(yīng)打開蓋子結(jié)構(gòu)，暴露出催化活性位點(diǎn)，隨后底物進(jìn)入活性區(qū)域，與脂肪酶形成四面體過(guò)渡態(tài)，進(jìn)而完成催化反應(yīng)。分子動(dòng)力學(xué)模擬雖然是通過(guò)大量的原子運(yùn)動(dòng)來(lái)優(yōu)化整個(gè)體系，但并沒(méi)有考慮時(shí)間維度，而是把大量動(dòng)力學(xué)模擬產(chǎn)生的構(gòu)象進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得到合理的平均構(gòu)象。因而，它無(wú)法描述化學(xué)鍵的形成與斷裂。

要研究脂肪酶過(guò)渡態(tài)的成鍵過(guò)程，必須使用量子力學(xué)的方法，但由于運(yùn)算量受到限制，人們尚無(wú)法對(duì)整個(gè)體系進(jìn)行量子力學(xué)計(jì)算。為解決這一難題，Warshel等[22]于 1974年首次提出了量子力學(xué)/分子力學(xué)（quantum mechanics/molecular mechanics，QM/MM）方法，該方法將整個(gè)催化體系分為兩部分，即精確的量子力學(xué)（quantum mechanics，QM）部分和快速的分子力學(xué)（molecular mechanics，MM）部分（見圖5），采用局部的量子力學(xué)研究酶與底物的成鍵問(wèn)題，其它理論研究則使用分子力學(xué)方法。使用QM/MM方法在一定程度上回避了量子力學(xué)計(jì)算量過(guò)大的問(wèn)題。眾多研究者運(yùn)用QM/MM方法針對(duì)多種脂肪酶的催化機(jī)理開展了更加深入的研究[2，23-26]（見表 2）。

值得關(guān)注的是，近年來(lái)人們基于另一種分子模擬方法，即定量構(gòu)效關(guān)系（quantitative structure activity relationships，QSAR）來(lái)精確預(yù)測(cè)脂肪酶的對(duì)映體選擇性，且預(yù)測(cè)值與理論值的相關(guān)性非常理想（R2＞ 0.9）[27-28]。QSAR，是運(yùn)用書寫模型來(lái)描述分子結(jié)構(gòu)與分子某種生物活性之間的關(guān)系。基本假設(shè)是化合物的結(jié)構(gòu)包含了其物理、化學(xué)以及生物信息，進(jìn)而決定了該化合物的性質(zhì)。該方法通過(guò)對(duì)少量底物的某種生物活性的實(shí)際測(cè)定，便可直接預(yù)測(cè)其它同系物的活性。這種方法雖然預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率高，但僅對(duì)同系物有效，其適用性不強(qiáng)。

4 存在問(wèn)題與展望

綜上所述，分子對(duì)接技術(shù)具有快速得到脂肪酶與底物復(fù)合物的優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于高通量預(yù)測(cè)脂肪酶對(duì)底物的選擇性研究，計(jì)算簡(jiǎn)單，但準(zhǔn)確性較差。而分子動(dòng)力學(xué)方法更接近于真實(shí)環(huán)境，準(zhǔn)確度較高，但其采用的點(diǎn)電荷模型具有不可極化現(xiàn)象和計(jì)算過(guò)程中無(wú)法形成或斷開共價(jià)鍵等缺點(diǎn)。QM/MM方法通過(guò)局部的量子力學(xué)計(jì)算，解決了分子動(dòng)力學(xué)方法無(wú)法成鍵的問(wèn)題，在脂肪酶催化機(jī)理研究方面顯示出較大優(yōu)勢(shì)。目前分子動(dòng)力學(xué)和QM/MM方法仍然存在運(yùn)算速度慢、預(yù)測(cè)精確度較差的問(wèn)題。而QSAR方法雖然預(yù)測(cè)精確度高，但僅局限于同系物。

表2 QM/MM的方法研究脂肪酶催化機(jī)理

隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，分子模擬技術(shù)在酶的性質(zhì)及催化機(jī)理研究方面的應(yīng)用將越來(lái)越廣泛。單一模擬方法已無(wú)法滿足研究的需要，聯(lián)合運(yùn)用多種模擬手段已成為現(xiàn)今研究的主流。當(dāng)計(jì)算機(jī)的運(yùn)算能力逐步提升到不再成為制約模擬方法的關(guān)鍵因素時(shí)，根據(jù)從頭計(jì)算的分子動(dòng)力學(xué)方法預(yù)測(cè)脂肪酶的空間結(jié)構(gòu)、全量子力學(xué)研究脂肪酶的催化機(jī)理以及新的更加精確的力場(chǎng)，如可極化力場(chǎng)下的分子動(dòng)力學(xué)等將更精確、更接近于真實(shí)環(huán)境，分子模擬技術(shù)將發(fā)揮出更加重要的作用。

[1]Park H J，Joo J C，Park K，et al.Prediction of the solvent affecting site and the computational design of stableCandida antarcticalipase B in a hydrophilic organic solvent[J].J.Biotechnol.，2013，163（3）：346-352.

[2]Ni Z，Lin X F.Insight into substituent effects in CAL-B catalyzed transesterification by combining experimental and theoretical approaches[J].J.Mol.Model.，2013，19：349-358.

[3]Alder B J，Wainwright T E.Studies in molecular dynamics.1.General method[J].J.Chem.Phys.，1959，31（2）：459-466.

[4]Norin M，Haeffner F，Hult K，et al.Molecular-dynamics simulations of an enzyme surrounded by vacuum，water，or a hydrophobic solvent[J].Biophys.J.，1994，67（2）：548-559.

[5]Peters G H，vanAalten D M F，Edholm O，et al.Dynamics of proteins in different solvent systems：Analysis of essential motion in lipases[J].Biophys.J.，1996，71（5）：2245-2255.

[6]Zuegg J，Honig H，Schrag J D，et al.Selectivity of lipases：Conformational analysis of suggested intermediates in ester hydrolysis of chiral primary and secondary alcohols[J].J.Mol.Catal.B：Enzym.，1997，3：83-98.

[7]Lengauer T，Rarey M.Computational methods for biomolecular docking[J].Curr.Opin.Struc.Biol.，1996，6（3）：402-406.

[8]Tafi A，van Almsick A，Corelli F，et al.Computer simulations of enantioselective ester hydrolyses catalyzed byPseudomonas cepacialipase[J].J.Org.Chem.，2000，65（12）：3659-3665.

[9]Tyagi S，Pleiss J.Biochemical profiling in silico-predicting substrate specificities of large enzyme families[J].J.Biotechnol.，2006，124（1）：108-116.

[10]Xu T，Zhang L J，Wang X D，et al.Structure-based substrate screening for an enzyme[J].BMC Bioinformatics.，2009，10：257-263.

[11]Juhl P B，Doderer K，Hollmann F，et al.Engineering ofCandida antarcticalipase B for hydrolysis of bulky carboxylic acid esters[J].J.Biotechnol.，2010，150（4）：474-480.

[12]Piamtongkam R，Duquesne S，Bordes F，et al.Enantioselectivity ofCandida rugosalipases (Lip1，Lip3，and Lip4) towards 2-bromo phenylacetic acid octyl esters controlled by a single amino acid[J].Biotechnol.Bioeng.，2011，108（8）：1749-1756.

[13]袁鵬，楊立榮，徐剛，等.共價(jià)對(duì)接法輔助模擬預(yù)測(cè)脂肪酶的對(duì)映體選擇性[J].化工進(jìn)展，2011，30 （8）：1815-1820.

[14]Rahman M Z A，Salleh A，Rahman RNZRA，et al.Unlocking the mystery behind the activation phenomenon of T1 lipase：A molecular dynamics simulations approach[J].Protein Sci.，2012，21（8）：1210-1221.

[15]Wedberg R，Abildskov J，Peters G H.Protein dynamics in organic media at varying water activity studied by molecular dynamics simulation[J].J.Phys.Chem.B，2012，116（8）：2575-2585.

[16]James J J，Lakshmi B S，Raviprasad V，et al.Insights from molecular dynamics simulations into pH-dependent enantioselective hydrolysis of ibuprofen esters byCandida rugosalipase[J].Protein Eng.，2003，16（12）：1017-1024.

[17]Ottosson J，F(xiàn)ransson L，Hult K.Substrate entropy in enzyme enantioselectivity：An experimental and molecular modeling study of a lipase[J].Protein Sci.，2002，11（6）：1462-1471.

[18]Raza S，F(xiàn)ransson L，Hult K.Enantioselectivity inCandida antarcticalipase B：A molecular dynamics study[J].Protein Sci.，2001，10（2）：329-338.

[19]Xu T，Zhang L J，Su E Z，et al.Disparity in productive binding mode of the slow-reacting enantiomer determines the novel catalytic behavior ofCandida antarcticalipase B[J].J.Mol.Catal.B：Enzym.，2010，62：288-296.

[20]Yagnik A T，Littlechild J A，Turner N J.Molecular modelling studies of substrate binding to the lipase fromRhizomucor miehei[J].J.Comput.Aid.Mol.Des.，1997，11（3）：256-264.

[21]Maraite A，Hoyos P，Carballeira J D，et al.Lipase fromPseudomonas stutzeri：Purification，homology modelling and rational explanation of the substrate binding mode[J].J.Mol.Catal.B：Enzym.，2013，87：88-98.

[22]Warshel A，Levitt M.Theoretical studies of enzymic reactions：Dielectric，electrostatic and steric stabilization of the carbonium ion in the reaction of lysozyme[J].J.Mol.Biol.，1976，103（2）：227-249.

[23]Luic M，Stefanic Z，Ceilinger I，et al.Combined X-ray diffraction and QM/MM study of theBurkholderia cepacialipase-catalyzed secondary alcohol esterification[J].J.Phys.Chem.B，2008，112：4876-4883.

[24]Tosa M，Pilbak S，Moldovan P，et al.Lipase-catalyzed kinetic resolution of racemic 1-heteroarylethanols-experimental and QM/MM study[J].Tetrahedron-Asymmetry，2008，19：1844-1852.

[25]Bellucci L，Laino T，Tafi A，et al.Metadynamics simulations of enantioselective acylation give insights into the catalytic mechanism ofBurkholderia cepacialipase[J].J.Chem.Theory.Comput.，2010，6：1145-1156.

[26]Brem J，Pilbak S，Paizs C，et al.Lipase-catalyzed kinetic resolutions of racemic 1-(10-ethyl-10H-phenothiazin-1,2，and 4-yl)ethanols and their acetates[J].Tetrahedron-Asymmetry，2011，22：916-923.

[27]Wang H K，Wang X J，Li X L，et al.QSAR study and the hydrolysis activity prediction of three alkaline lipases from different lipase-producing microorganisms[J].Lipids Health Dis.，2012，11：124-132.

[28]Gu J L，Liu J，Yu H W.Quantitative prediction of enantioselectivity ofCandida antarcticalipase B by combining docking simulations and quantitative structure-activity relationship (QSAR) analysis[J].J.Mol.Catal.B：Enzym.，2011，72：238-247.