響應(yīng)面法優(yōu)化鴨胸肉鹽溶蛋白的提取工藝

王 偉，汪夢非，姚 遙，姜發(fā)堂，肖 滿，倪學(xué)文

（湖北工業(yè)大學(xué)輕工學(xué)部食品與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430068）

肌肉鹽溶蛋白占肌肉的70%～90%，是影響肉蛋白凝膠功能特性的主要肌肉蛋白，直接影響肉制品的組織特性、保水性、黏結(jié)性和產(chǎn)品得率[1]，因此鹽溶性蛋白的性能決定肉制品的最終品質(zhì)[2]。鹽溶蛋白是肉糜形成彈性凝膠的主要成分之一，在制備肉糜﹑重組肉等其他產(chǎn)品過程中，鹽溶蛋白的浸出率對后序加工、制品的品質(zhì)有著舉足輕重的作用。鹽溶蛋白的高浸出率，有利于改良肉糜的質(zhì)構(gòu)，提高肉的加工性能。目前肉制品如在火腿的的滾揉工序中，其主要目的就是使鹽溶蛋白盡可能多的浸出。但對于鴨肉加工來說，滾揉對鹽溶蛋白的浸出影響不大，因此就要對其他條件進(jìn)行研究[3]。白艷紅等[4]利用響應(yīng)面優(yōu)化法研究pH、NaCl、MgCl2和復(fù)合磷酸鹽（MP）對豬后腿肉鹽溶蛋白提取率的影響；丁寧等[5]采用響應(yīng)面分析法對鯊魚鹽溶蛋白的提取條件NaCl濃度、pH和低溫加熱時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化；王莉莉[6]對鵝肉鹽溶蛋白質(zhì)的提取條件進(jìn)行了研究，確定了NaCl濃度、提取液pH、浸提時(shí)間3個(gè)因素的取值范圍；Boyer等[7]研究了離子強(qiáng)度對兔肉的鹽溶蛋白的影響；Shikha等[8]在研究了pH對鹽溶肉蛋白的影響后發(fā)現(xiàn)提高pH使鹽溶蛋白偏離其等電點(diǎn)，且而關(guān)于鴨肉鹽溶蛋白提取的研究報(bào)道較少。本文通過對鴨肉鹽溶蛋白提取過程中影響因素的分析，在單因子實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面法（RSM）對鴨肉鹽溶蛋白的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，提高鴨肉鹽溶蛋白的提取率，得到最佳的鹽溶蛋白提取工藝，為鴨肉的進(jìn)一步綜合開發(fā)和合理利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鴨胸肉選自湖北本地的荊江麻鴨 武漢南湖中商超市冷凍鴨胸肉，屠宰期不超過一周；考馬斯亮藍(lán)G250、牛血清蛋白 湖北晶茂生物科技有限公司；NaCl 分析純，山東萊陽市雙雙化工有限公司。

GL-52型高速冷凍離心機(jī) 湖南長沙平凡儀器儀表有限公司；BP221S型電子分析天平 德國Sartorius公司）；DS-1型組織搗碎機(jī) 浙江金壇市華龍實(shí)驗(yàn)儀器廠；FE20型pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV 1900型紫外可見分光光度計(jì) 上海荊和分析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 預(yù)處理 鴨胸肉剔除筋鍵、脂肪后，切成小塊裝于保鮮袋，-18℃以下凍藏，使用前于4℃下解凍。

1.2.2 鴨肉鹽溶蛋白的提取 根據(jù)DeFreitas[9]和Bertram[10]的方法，并略作改進(jìn)如下：鴨肉與一定濃度的鹽溶液按比例倒入組織搗碎機(jī)攪成肉漿狀，4℃靜止一段時(shí)間后，以12000×g在4℃下離心30min，上清液用3層濾布過濾，去離子水稀釋至鹽濃度小于0.1mol/L，離心收集上清液，然后用去離子水稀釋上清液，重復(fù)上述過程，得到的上清液即鹽溶蛋白溶液。

1.2.3 鴨肉鹽溶蛋白的測定 參考王孝平等[11]考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 浸提時(shí)間對鹽溶蛋白提取量的影響 在鹽濃度0.5mol/L、固液比1∶4、浸提溶液pH7.5條件下，實(shí)驗(yàn)分五個(gè)水平，提取時(shí)間分別為1、5、10、15、20h。提取鹽溶蛋白后，每組分別取1.0mL，測其蛋白濃度。

1.2.4.2 NaCl濃度對鹽溶蛋白提取量的影響 在pH=7.0，固液比1∶4，提取時(shí)間10h的條件下，研究0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mol/L的氯化鈉溶液對提取鹽溶蛋白的影響。提取鹽溶蛋白后，每組分別取1.0mL，測其蛋白濃度。

1.2.4.3 固液比對鹽溶蛋白提取量的影響 在鹽濃度0.5mol/L、浸提時(shí)間10h、浸提溶液pH為7.5條件下，實(shí)驗(yàn)分五個(gè)梯度，固液比（g/V）分別為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6。提取鹽溶蛋白后，每組分別取1.0mL，測其蛋白含量，然后根據(jù)固液比例乘以稀釋倍數(shù)得到每組的蛋白總量。

1.2.4.4 浸取溶液的pH對鹽溶蛋白提取量的影響 肌肉蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在pH5.5～6.0時(shí)肌肉蛋白的提取對pH較為敏感。根據(jù)文獻(xiàn)資料，肉類鹽溶蛋白提取pH通常在6.0～8.5之間，因此選取pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，固定鹽濃度0.5mol/L、固液比1∶4、浸提時(shí)間10h。

1.2.5 響應(yīng)面（RSM）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)Box-Behnken中心設(shè)計(jì)原理，以NaCl濃度、浸提溶液pH、固液比、浸提時(shí)間四個(gè)因素為自變量，并以-1、0、1分別代表自變量的低、中、高水平，以鴨肉鹽溶蛋白提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)27個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，其中24個(gè)析因點(diǎn)，3個(gè)零點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)因素見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 The levels and factors of response surface experimental

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行，取平均值。數(shù)據(jù)采用SAS 9.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[12-14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)及分析

2.1.1 浸提時(shí)間對鹽溶蛋白提取量的影響 由圖1分析可知，在NaCl濃度、浸提溶液pH、固液比不變的情況下，0～5h蛋白含量曲線的斜率最大，說明此時(shí)溶液中蛋白浸出速度快。這是因?yàn)槿芤褐械鞍缀康?，肉中的蛋白含量高，滲透壓大，蛋白迅速向溶液中擴(kuò)散；5～10h，隨時(shí)間的延長，溶液中蛋白含量增加的速度有所減緩（p＜0.05），這是因?yàn)榻?jīng)過一段時(shí)間的擴(kuò)散，肉和溶液中的蛋白濃度差縮小，滲透壓減小所致[15]；10h后，溶液中的蛋白濃度接近肉中的蛋白濃度，鹽溶蛋白已基本溶出。如果時(shí)間過長，蛋白質(zhì)的性質(zhì)會發(fā)生變化，細(xì)菌也會大量滋生，不利于后期實(shí)驗(yàn)，綜合考慮，10h是比較合理的浸提時(shí)間。

2.1.2 NaCl濃度對鹽溶蛋白提取量的影響 由圖2可以看出，鹽濃度在0.1～0.5mol/L時(shí)，蛋白含量隨著鹽濃度的提高而增加；在0.5～0.9mol/L，蛋白濃度隨著鹽濃度的升高而降低。這是因?yàn)辂}濃度能夠改變氨基酸側(cè)鏈的電荷分布，改變鹽溶蛋白在溶液中的存在狀態(tài)，使蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用降低或增加，進(jìn)而影響其溶解性。因此，鹽濃度0.5mol/L是較優(yōu)的選擇。

2.1.3 固液比對鹽溶蛋白提取量的影響 在圖3中，在固液比為1∶2時(shí)，由于提取液太粘稠，在高速離心下無法分層，從而無法測定。固液比1∶3～1∶5時(shí)，蛋白質(zhì)的總含量隨著固液比值的減小而顯著增加（p＜0.05），但到1∶6時(shí)，蛋白總量增加較少?？紤]到固液比值太小，對下一步驟離心過程的影響，所以固液比選擇1∶5。

2.1.4 浸取溶液的pH對鹽溶蛋白提取量的影響 保持NaCl濃度等其他因素不變，在浸提溶pH6.0～7.5，蛋白質(zhì)提取率呈上升趨勢，而在pH7.5～8.5，蛋白質(zhì)提取率逐漸下降。原因是蛋白質(zhì)分子既含有酸性基團(tuán)，又含有堿性基團(tuán)，高pH使鹽溶蛋白質(zhì)偏離其等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)分子帶有同種電荷，互相排斥，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用減弱，而蛋白質(zhì)和水之間的相互作用則加強(qiáng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度變大，溶液中的蛋白含量增加，但過高的pH會引起蛋白質(zhì)變性，而且在堿性條件下也不利于防腐，綜合考慮，浸提溶液的pH選擇7.5。

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

通過對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，所選用的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性（p＜0.0001）。經(jīng)過二次回歸擬合后，得出擬合方程式為：

Y=18.7+0.875X1+1.316667X2+1.016667X3+3.841667X4-0.791667X12-0.175X1X2-0.275X1X3-0.075X1X4-2.654167X22+1.1X2X3-0.625X2X4-2.029167X32-0.375X3X4-2.766667X42。其中復(fù)相相關(guān)系數(shù)R2=96.21%，修正決定系數(shù)為91.79%，說明該模型能解釋91.79%響應(yīng)值的變化，僅有總變異6.51%不能用此模型來解釋，所以該模型擬合程度良好，用該模型對鴨肉鹽溶蛋白提取工藝進(jìn)行優(yōu)化是合適的。

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值結(jié)果Table 2 Experimental design and response value

表3 方差分析Table 3 The analysis of anova

圖5 浸提溶液pH、浸提時(shí)間、溶液NaCl濃度、固液比交互影響提取率的曲面圖Fig.5 The surface chart of extraction solution pH，extraction solution concentration of NaCl，material to water ratio，extraction-duration

方差分析表明（表3），X2、X4、X22、X32、X42對蛋白提取率的影響極顯著（p＜0.001），表明在提取鴨肉鹽溶蛋白的過程中，NaCl濃度、浸提溶液pH、固液濃度的平方項(xiàng)、固液比的平方項(xiàng)、浸提溶液pH的平方項(xiàng)對鹽溶蛋白提取的影響極顯著（p＜0.01）。X1、X3、X2X3影響顯著（p＜0.05），即在提取過程中，浸提時(shí)間、固液比、NaCl濃度和固液比的交互作用對提取率的影響顯著（p＜0.05）。

根據(jù)回歸方程，作出響應(yīng)面立體圖，見圖5。從圖5（a）～5（c）可以看出，保持其他因素不變，蛋白質(zhì)提取率隨著浸提時(shí)間先上升，然后達(dá)到穩(wěn)定。保持浸提時(shí)間不變時(shí)，隨著NaCl濃度的增加，蛋白質(zhì)提取率先增高后降低。隨著固液比的比例增大，蛋白質(zhì)提取率上升后趨于平穩(wěn)。其中，由圖5（c）可以看出，保持浸提時(shí)間不變，蛋白質(zhì)提取率隨著pH的上升而先上升后下降，這是因?yàn)樘岣遬H使鹽溶蛋白偏離其等電點(diǎn)，使蛋白質(zhì)的凈電負(fù)荷增加，造成蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用減弱，和水的相互作用增加，蛋白質(zhì)的溶解度增大，鹽溶蛋白提取充分；但過高的pH會使蛋白質(zhì)變性。本研究結(jié)果與Shikha等[8]的研究一致。圖5（d）顯示在固液比不變的情況下，隨著NaCl濃度的增加，蛋白質(zhì)提取率先增高后降。圖5（e）可知，保持pH不變，隨著NaCl濃度的上升，鹽溶蛋白提取率先上升后下降，因?yàn)镹aCl濃度能夠改變氨基酸側(cè)鏈的電荷分布，進(jìn)而影響其溶解性，對蛋白提取率產(chǎn)生顯著的影響（p＜0.001）。由圖5（f）可知，相比固液比，浸提溶液pH對蛋白質(zhì)提取率有著明顯的影響，保持固液比不變，蛋白質(zhì)提取率隨著pH的上升而先上升后緩慢下降。

以上4個(gè)因素對鹽溶蛋白提取率的影響從大到小依次為：浸提溶液pH（X4）＞溶液NaCl濃度（X2）＞固液比（X3）＞浸提時(shí)間（X1），即浸提溶液pH和NaCl濃度對提取率的影響最為顯著。最佳提取工藝條件：浸提溶液pH7.65、NaCl濃度0.52mol/L、固液比1∶5.21、浸提時(shí)間12.31h，鴨肉鹽溶蛋白提取率的響應(yīng)值為20.4%。

2.3 最佳條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

考慮到實(shí)際的可操作性，將以上最佳條件修正為浸提溶液pH7.7、NaCl濃度0.5mol/L、固液比1∶5.2、浸提時(shí)間12.3h，在此條件下進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)，得到鴨肉鹽溶蛋白提取率的平均值為19.9%，與理論值接近，說明采用RSM法優(yōu)化得到的提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面法優(yōu)化鴨肉鹽溶蛋白提取實(shí)驗(yàn)，以鴨肉鹽溶蛋白提取率作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了四因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明浸提溶液pH、NaCl濃度、NaCl濃度的平方項(xiàng)、固液比的平方項(xiàng)、浸提溶液pH的平方項(xiàng)對蛋白提取率的影響極顯著（p＜0.001），并得到鴨胸肉鹽溶蛋白的最佳提取工藝條件：浸提溶液pH7.7、NaCl濃度0.5mol/L、固液比1∶5.2、浸提時(shí)間12.3h，鴨肉鹽溶蛋白提取率的響應(yīng)值為20.4%，鴨肉鹽溶蛋白的實(shí)際提取率為19.9%，相對誤差為2.5%。本文為鴨肉鹽溶蛋白的提取提供了一定的指導(dǎo)。

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