竹蓀多糖提取方法的比較研究

張素斌，李曉平

（肇慶學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東肇慶526061）

竹蓀（Dictyophora duplicata），屬于真菌門、擔(dān)子菌亞門、腹菌綱、鬼筆目、鬼筆科、竹蓀屬真菌[1]。竹蓀是世界上名貴的大型食用菌之一，營養(yǎng)豐富，脆嫩爽口，素有“真菌皇后”之美譽(yù)。竹蓀含有蛋白質(zhì)、多種氨基酸、維生素、多糖和多種微量元素等營養(yǎng)成分，其所含的多糖是具有高活性的大分子物質(zhì)，在抗腫瘤[2]、抗凝血[3]、抗炎癥[4]、刺激免疫以及降血壓、血糖[1]方面都有一定的療效。食用菌生物多糖是一種非特異性免疫增強(qiáng)劑和免疫激活劑，廣泛用于醫(yī)藥和保健食品，被稱為“生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑”[5]。食用菌多糖的提取方法有熱水浸提法、酸堿浸提法、超聲波法、微波法、酶法、超聲酶法等[5-6]，但文獻(xiàn)多局限于對其中的兩或三種方法的比較。目前對竹蓀多糖的提取方法研究不多，已報道的有熱水提取法[7]、復(fù)合酶法[8]。近年來，有關(guān)食用菌多糖的研究很多，人們一直在努力尋找提取多糖的最佳方法以及不斷獲得新的功能性多糖資源。隨著竹蓀人工栽培規(guī)模的不斷擴(kuò)大，作為一種名貴的食用菌，對竹蓀的研究也逐漸深入。本文以竹蓀為原料，分別用熱水提取法、超聲波法、纖維素酶法、果膠酶法、木瓜蛋白酶法、復(fù)合酶法、超聲復(fù)合酶法提取竹蓀多糖，以竹蓀多糖提取率為指標(biāo)，采用單因素實驗或正交實驗優(yōu)化竹蓀多糖的提取工藝，并對7種提取方法進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

竹蓀 產(chǎn)地為福建古田，購自肇慶大潤發(fā)超市；苯酚、亞鐵氰化鉀、次甲基藍(lán)、葡萄糖 均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、硫酸、冰乙酸、乙酸鈉、乙酸鋅、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、NaOH、HCl 均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠；纖維素酶（2000IU/g）、木瓜蛋白酶（80.0萬IU/g）、果膠酶（2.0萬IU/g） 北京鴻潤寶順科技有限公司。

S22PC型可見分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司；SK8200H型臺式超聲清洗儀 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；HH-S2系列恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；AUY120型電子分析天平Shimadzu Corporation Janpan；pHS-29A型酸度計 上海大普儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取在105℃下烘干至恒重的葡萄糖0.1039g，置于小燒杯中，加水溶解定容至100mL，吸取10mL再定容至100mL。準(zhǔn)確吸取所得0.1039mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL分別置于具塞刻度試管中，各加入蒸餾水使總體積為2.0mL，再分別加5%苯酚試液1.0mL，搖勻，迅速加濃硫酸5.0mL，搖勻后放置10min，置于沸水浴中加熱15min，取出流水冷卻至室溫，另以蒸餾水2.0mL加5%苯酚和硫酸作空白對照，于487nm波長處測吸光度。結(jié)果得回歸方程為Y=6.096X-0.003（X為葡萄糖濃度，mg/mL），r=0.9993。

1.2.2 竹蓀多糖提取的工藝流程

1.2.2.1 樣品處理 用粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，在65～70℃烘干至恒重，密封備用。

1.2.2.2 熱水提取、超聲波提取與酶法提取 準(zhǔn)確稱取2g竹蓀，置于燒杯中，加入蒸餾水，分別用恒溫?zé)崴?、超聲提取一定時間，或加入HAc-NaAc緩沖溶液，加酶保溫一定時間，加熱滅酶。將不同方法的提取液冷卻，轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶，定容，過濾，濾液備用。

1.2.2.3 超聲復(fù)合酶法提取 準(zhǔn)確稱取2g竹蓀，置于燒杯中，加入HAc-NaAc緩沖溶液，加復(fù)合酶保溫一定時間，加熱滅酶，冷卻，超聲提取一定時間，冷卻，轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶，定容，過濾，濾液備用。

1.2.3 竹蓀中還原糖與蔗糖等低聚糖總量的測定 準(zhǔn)確稱取2g竹蓀，置于250mL容量瓶中，加入100mL水，在45℃水浴中提取30min，冷卻，加入5mL醋酸鋅與5mL亞鐵氰化鉀溶液，加水至刻度，混勻，靜置30min，干濾紙過濾，棄去初濾液。取濾液50mL至100mL容量瓶，加入6mol/L的HCl 5mL，在68～70℃水浴加熱15min，冷卻，加2滴甲基紅，加入20%NaOH中和，定容，備用[9]。根據(jù)GB/T 5009.7-2003食品中還原糖測定法中的直接滴定法測定還原糖含量[10]。竹蓀中還原糖與蔗糖等低聚糖的總量見式（1）：

還原糖與蔗糖等低聚糖的總量（%）

式中：F為10mL堿性酒石酸銅溶液相當(dāng)于葡萄糖的質(zhì)量（mg）；V1為滴定時平均消耗樣液的體積（mL）；m為樣品質(zhì)量（g）。

1.2.4 多糖提取率計算 準(zhǔn)確吸取1.0mL竹蓀提取液，定容至50mL，再準(zhǔn)確吸取2mL，按1.2.1從“加5%苯酚試液1.0mL”起操作，在487nm波長處測定吸光度A，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品液中竹蓀總糖的含量。總糖含量見式（2）：

式中：X為測定樣液總糖濃度（mg/mL）；n為測定樣液的稀釋倍數(shù)；V為樣液總體積（mL）；m為樣品質(zhì)量（g）。

多糖提取率見式（3），若采用酶法及超聲酶法用式（4）：

多糖提取率（%）=總糖含量（%）-還原糖與蔗糖等低聚糖總量（%） 式（3）

多糖提取率（%）=總糖含量（%）-還原糖與蔗糖等低聚糖總量（%）-酶空白（%） 式（4）

2 結(jié)果與分析

2.1 熱水提取、超聲波提取與酶法提取結(jié)果與分析

2.1.1 熱水提取法 按照1.2.2.2所述工藝流程用熱水提取竹蓀多糖，參考文獻(xiàn)[11-13]，考察影響熱水提取效果的三個主要因素：料液比、溫度、時間，每個因素取3個水平進(jìn)行實驗設(shè)計，正交實驗設(shè)計及結(jié)果見表1。

表1 熱水提取法正交實驗設(shè)計及結(jié)果Table 1 Orthogonal array design for optimizing hot water extraction and test results

由表1可知，最佳提取條件為A3B3C2，即料液比為1∶50，提取溫度為90℃，提取時間為3h，竹蓀多糖提取率為9.77%。在所選的因素及其水平范圍內(nèi)，對竹蓀多糖提取率影響最大的是提取溫度，其次是料液比，提取時間影響很小。由極差可知，時間減少為2h對結(jié)果影響不大，由于本文側(cè)重比較各方法的提取率，因此仍選擇3h為最佳。

2.1.2 超聲波提取法 按照1.2.2.2所述工藝流程用超聲波法提取竹蓀多糖，因所用的超聲儀不可調(diào)節(jié)溫度與功率，超聲功率固定為500W。用單因素實驗確定料液比與超聲時間。

2.1.2.1 料液比的確定 選定超聲時間為30min，僅改變料液比（g/mL）為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，測定結(jié)果見圖1。由圖1可知，當(dāng)料液比在1∶20～1∶40時，多糖提取率呈上升趨勢，料液比為1∶50時多糖提取率有所下降。在料液比達(dá)到1∶40之前，可能是由于樣品為干品，本身也要吸收一部分水，加水太少，多糖溶出一定程度后溶液達(dá)到飽和，多糖就不能繼續(xù)溶出。因此選定料液比為1∶40。

2.1.2.2 超聲時間的確定 選定料液比為1∶40，超聲時間分別選擇為20、30、40、50、60min進(jìn)行實驗，結(jié)果見圖2。由圖2可知，最佳超聲時間為30min，多糖提取率為6.64%。這可能由于超聲時間過低時，多糖不能充分溶出，而時間過長又會使多糖結(jié)構(gòu)被破壞，使多糖提取率下降。

2.1.3 纖維素酶法 按照1.2.2.2所述工藝流程用纖維素酶法提取竹蓀多糖，參考文獻(xiàn)[14-16]，選擇加酶量、酶解溫度、酶解時間、酶解pH 4個因素為纖維素酶提取法的影響因素進(jìn)行正交實驗，實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。實驗結(jié)果表明最佳提取條件為A2B3C2D3，即纖維素酶加酶量為0.5%，酶解溫度為60℃，酶解時間60min，酶解pH為6。各因素對竹蓀多糖提取率的影響順序為：加酶量＞酶解pH＞酶解時間＞酶解溫度。按最佳提取條件進(jìn)行驗證實驗，測得竹蓀多糖提取率為8.84%，大于正交實驗中的最高值8.03%。

2.1.4 果膠酶法 按照1.2.2.2所述工藝流程用果膠酶法提取竹蓀多糖，參考文獻(xiàn)[14，17]，選擇加酶量、酶解溫度、酶解時間、酶解pH 4個因素為果膠酶提取法的影響因素進(jìn)行正交實驗，實驗設(shè)計及結(jié)果見表3。實驗結(jié)果表明最佳提取條件為A3B2C2D3，即果膠酶加酶量為1.0%，酶解溫度為50℃，酶解時間60min，酶解pH為5.5。各因素對竹蓀多糖提取率的影響順序為：加酶量＞pH＞酶解時間＞酶解溫度。按最佳提取條件進(jìn)行驗證實驗，測得竹蓀多糖提取率為10.06%，大于正交實驗中的最高值9.54%。

表2 纖維素酶法正交實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design for optimizing cellulase extraction and test results

表3 果膠酶法正交實驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Orthogonal array design for optimizing pectinase extraction and test results

2.1.5 木瓜蛋白酶法 按照1.2.2.2所述工藝流程用木瓜蛋白酶法提取竹蓀多糖，參考文獻(xiàn)[14-15，18]，選擇加酶量、酶解溫度、酶解時間、酶解pH 4個因素為木瓜蛋白酶提取法的影響因素進(jìn)行正交實驗，正交實驗設(shè)計及結(jié)果見表4。實驗結(jié)果表明最佳提取條件為A3B1C2D3，即木瓜蛋白酶加酶量為1.0%，酶解溫度為40℃，酶解時間60min，酶解pH為5.5。各因素對竹蓀多糖提取率的影響順序為：加酶量＞pH＞酶解時間＞酶解溫度。按最佳提取條件進(jìn)行驗證實驗測得竹蓀多糖提取率為10.35%，大于正交實驗中的最高值10.06%。

2.1.6 復(fù)合酶法 根據(jù)纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶的實驗結(jié)果（表2～表4）可知，各因素對竹蓀多糖提取率的影響順序均為：加酶量＞pH＞酶解時間＞酶解溫度，說明加酶量及酶解pH對實驗結(jié)果的影響較大，酶解時間影響較小，酶解溫度的影響最小，即在40～60℃溫度范圍內(nèi)進(jìn)行酶解對實驗結(jié)果影響很小，因此固定酶解溫度為50℃，而三種酶的酶解時間均為60min，因此固定復(fù)合酶解時間為60min。按照1.2.2.2所述工藝流程用復(fù)合酶法提取竹蓀多糖，選擇纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶的加酶量以及酶解pH4個因素為復(fù)合酶提取法的影響因素進(jìn)行正交實驗，實驗設(shè)計及結(jié)果見表5。實驗結(jié)果表明最佳工藝條件為A1B2C3D3，即纖維素酶量為0.25%，加果膠酶酶量為0.5%，加木瓜蛋白酶酶量為1.0%，酶解pH為6。各因素對竹蓀多糖提取率的影響順序為：果膠酶量＞纖維素酶量＞酶解pH＞木瓜蛋白酶量。按最佳提取條件進(jìn)行驗證實驗測得竹蓀多糖提取率為11.27%，大于正交實驗中的最高值10.69%。由于纖維素酶可以破壞植物細(xì)胞壁，果膠酶和木瓜蛋白酶可以將果膠質(zhì)和蛋白質(zhì)水解，使多糖溶出增加，三種酶的共同作用，對多糖成分的溶出有較大的促進(jìn)作用。

表4 木瓜蛋白酶法正交實驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Orthogonal array design for optimizing papain extraction and test results

表5 復(fù)合酶法正交實驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Orthogonal array design for optimizing multi-enzymatic extraction and test results

2.2 超聲復(fù)合酶法提取結(jié)果與分析

根據(jù)超聲波提取、纖維素酶提取、果膠酶提取、木瓜蛋白酶提取及復(fù)合酶提取的實驗結(jié)果，固定加纖維素酶量為0.25%，加果膠酶酶量為0.5%，加木瓜蛋白酶酶量為1%，酶解溫度為50℃，按照1.2.2.3所述超聲復(fù)合酶法提取的工藝流程，選擇料液比、酶解時間、酶解pH以及超聲時間4個因素為超聲復(fù)合酶提取法的影響因素進(jìn)行正交實驗，實驗設(shè)計及結(jié)果見表6。由表6可知，最佳提取條件A3B2C3D3，即料液比為1∶50，酶解時間60min，酶解pH為6，超聲時間為40min。各因素對竹蓀多糖提取率的影響順序為：料液比＞超聲時間＞酶解時間＞酶解pH。按最佳提取條件進(jìn)行驗證實驗測得竹蓀多糖提取率為16.35%，大于正交實驗中的最高值16.11%。這可能是因為多種酶的水解作用與超聲的熱效應(yīng)和空化作用相結(jié)合而使多糖提取率大大提高。

表6 超聲酶法正交實驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Orthogonal array design for optimizing ultrasonic combined with multi-enzymatic extraction and test results

2.3 七種多糖提取方法的比較

本文通過分別采用熱水提取法、超聲波法、纖維素酶法、果膠酶法、木瓜蛋白酶法、復(fù)合酶法、超聲復(fù)合酶法提取竹蓀多糖，得出各種方法的最佳提取條件以及在最佳條件下的竹蓀多糖提取率。不同方法的多糖提取率及提取時間見表7。

從表7看出，果膠酶法與熱水提取法、木瓜蛋白酶法的多糖提取率差異不顯著，用纖維素酶法所得多糖提取率較低，但復(fù)合酶法則比熱水提取法的多糖提取率高，而幾種酶法提取所用時間均比熱水提取法要短。并不是所有酶都能使竹蓀的多糖提取率增加，用果膠酶與木瓜蛋白酶處理竹蓀對多糖的溶出促進(jìn)作用較大，三種酶的聯(lián)合作用更佳。超聲波法用時最短，但多糖提取率也最低，這與姜寧[19]、賁永光[20]的結(jié)論不同，可能與樣品不同有關(guān)。將復(fù)合酶法與超聲波法相結(jié)合提取多糖時，多糖提取率大幅提高，所用時間也比熱水提取法大為減少，這與陶濤[21]、謝麗源[22]結(jié)論一致，即超聲酶法對多糖提取有較大促進(jìn)作用。

表7 七種提取方法的比較Table 7 Comparison of seven methods

多糖類化合物廣泛存在于動物細(xì)胞膜和植物、微生物的細(xì)胞壁中，因此先用復(fù)合酶處理竹蓀樣品，纖維素酶與果膠酶可破壞竹蓀細(xì)胞壁，使其結(jié)構(gòu)變得松散，木瓜蛋白酶降低了多糖與蛋白質(zhì)的結(jié)合，幾種酶的聯(lián)合作用有利于多糖的溶出，再結(jié)合超聲波處理，可以使多糖提取率大為增加，因此超聲酶法是一種省時、高效的多糖提取方法。

3 結(jié)論

超聲復(fù)合酶法提取竹蓀多糖的最佳條件是料液比1∶50，酶解時間60min，酶解pH6，超聲時間40min，多糖提取率為16.35%，而熱水提取法多糖提取率為9.77%，超聲波法為6.64%，纖維素酶法為8.84%，果膠酶法為10.06%，木瓜蛋白酶法為10.35%，復(fù)合酶法為11.27%。與熱水提取法、超聲波法、酶法比較，超聲復(fù)合酶法提取的竹蓀多糖提取率最高，所需時間也比一般的熱水提取法大為減少，為竹蓀多糖提取的較好方法。

[1]張靜雯.竹蓀的營養(yǎng)價值及食用方法[J].甘肅農(nóng)業(yè)，2011（1）：87-88.

[2]趙凱，王飛娟，潘薛波，等.紅托竹蓀菌托多糖的提取及抗腫瘤活性的初步研究[J].菌物學(xué)報，2008，27（2）：289-296.

[3]林玉滿，蘇愛華.短裙竹蓀（Dityophoraduplicata）凝集素純化與生化性質(zhì)[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2005，21（1）：101-107.

[4]袁德培.竹蓀的研究進(jìn)展[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2006，23（4）：39-41.

[5]孫靖軒，王延鋒，王金賀，等.食用菌多糖提取技術(shù)研究概況[J].中國食用菌，2012，31（3）：6-9.

[6]王雪冰，趙天瑞.食用菌多糖提取技術(shù)研究概況[J].中國食用菌，2010，29（2）：3-6.

[7]高擎，華洋林，趙謀明.響應(yīng)面法優(yōu)化提取竹蓀多糖的工藝研究[J].現(xiàn)代食品科技，2010，26（8）：826-829.

[8]葉敏.復(fù)合酶法提取紅托竹蓀多糖的工藝研究[J].吉林師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2012（2）：145-147.

[9]華南理工大學(xué)，大連輕工業(yè)學(xué)院，鄭州輕工業(yè)學(xué)院，等.食品分析[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2006：177-178.

[10]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB/T5009.1～5009.100-2003，中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)，食品衛(wèi)生檢驗方法理化部分（一）[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004：42-45.

[11]高愿軍，張家泉，司俊娜，等.響應(yīng)面法優(yōu)化樺褐孔菌多糖提取工藝[J].食品研究與開發(fā)，2009，30（6）：7-10.

[12]岳金玫，蒲彪，陳安均，等.響應(yīng)面法優(yōu)化塊菌多糖的提取工藝[J].食品工業(yè)科技，2012，33（19）：271-274.

[13]陳丹紅.均勻設(shè)計優(yōu)化雞腿菇多糖提取工藝的研究[J].食品科技，2011，36（2）：154-157.

[14]程俊文，吳學(xué)謙，賀亮，等.香菇子實體多糖分步酶解法提取研究[J].食用菌學(xué)報，2009，16（2）：67-71.

[15]朱彩平，惠樂樂，柳小林，等.酶法提取平菇多糖工藝研究[J].中成藥，2011，33（8）：1435-1438.

[16]張利，范明才，馮喜文，等.鐵皮石斛中石斛多糖與石斛堿的纖維素酶法提取研究[J].化學(xué)研究與應(yīng)用，2011，23（3）：356-359.

[17]姜紅，孫宏鑫，李晶，等.酶法提取黑木耳多糖[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（6）：131-133.

[18]梁敏，鄒東恢，劉軍.酶法提取金針菇多糖的研究[J].食品研究與開發(fā)，2012，33（11）：100-102.

[19]姜寧，劉曉鵬，吳紅江，等.金針菇菌絲體多糖超聲提取工藝的研究[J].食品科學(xué)，2008，29（8）：289-292.

[20]賁永光，鐘紅茂，李康，等.超聲輔助提取螺旋藻多糖的實驗研究性研究[J].中成藥，2011，33（6）：1078-1080.

[21]陶濤，李立祥，張芳，等.超聲波協(xié)同纖維素酶對黃精多糖和皂苷的提取研究[J].食品工業(yè)科技，2012，33（9）：271-275.

[22]謝麗源，王富偉，李洪軍，等.超聲波復(fù)合酶法提取桑黃多糖研究[J].食品科學(xué)，2010，31（10）：81-85.