不同加工方法對(duì)北沙參多糖免疫調(diào)節(jié)功能的實(shí)驗(yàn)研究

榮立新，魯 爽，劉詠梅

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院，北京 100053)

北沙參又名海沙參、野沙參、萊陽(yáng)沙參、遼沙參等，為傘形科植物珊瑚菜 Glehnia littoralis Fr.Schmidt ex Miq.的干燥根，具有養(yǎng)陰清肺、益胃生津之功效，主要用于肺熱燥咳、勞嗽痰血、熱病津傷口渴。北沙參主要分布于山東、河北、內(nèi)蒙，在遼寧、江蘇、廣東、福建等省區(qū)也有分布，其中以山東萊陽(yáng)栽培歷史最為悠久、產(chǎn)量大、質(zhì)量好，故又名“萊陽(yáng)沙參”。傳統(tǒng)的藥材加工方法是在夏秋兩季采挖，除去須根，洗凈，稍晾，置沸水中燙后除去外皮，或洗凈直接干燥［1］。研究表明，多糖是其中主要成分，可增強(qiáng)機(jī)體免疫功能［2，3］。本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)去皮北沙參和未去皮北沙參中的粗多糖提出，得去皮北沙參粗多糖(GLP1)和未去皮北沙參粗多糖(GLP2)。并以甲亢型陰虛小鼠為研究對(duì)象，比較GLP1和GLP2對(duì)陰虛小鼠體液免疫和細(xì)胞免疫功能的影響，揭示其滋陰作用的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，以此改進(jìn)北沙參炮制工藝，為今后北沙參的炮制加工和臨床應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)［4］。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物

6～8周齡雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量20±2g，購(gòu)于濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物合格證號(hào)魯動(dòng)環(huán)字200007001號(hào))。

1.2 藥物

北沙參采自于山東省萊陽(yáng)市胡城北沙參種植基地，經(jīng)鑒定為傘形科植物珊瑚菜(Glehnia littoralis F.Schmidt ex Miq.)的根。去皮北沙參:取新鮮北沙參根略晾、理順，先將根細(xì)端置沸水中略燙，再將整體置沸水中煮約5～10 min，至根皮易撥離時(shí)取出，刮去皮、干燥。不去皮北沙參:取新鮮北沙參根，用清水洗凈、理順、干燥。

1.3 試劑

小牛血清(杭州四季青生物材料公司)，甲狀腺素片(萊陽(yáng)生物化學(xué)制藥廠)，利血平(上海醫(yī)科大學(xué)紅旗制藥廠)，PRMI-1640培養(yǎng)液(美國(guó)Gibico公司)，MTT、ConA(華美生物工程公司)，羊抗小鼠IgM-生物素(北京中山生物公司)，所用試劑均為分析純。

1.4 主要儀器

J2-MC BECKMAN高速冷凍離心機(jī)(Bechman公司)，HH型電熱恒溫水浴鍋(江蘇金壇市宏凱儀器廠)，Model450型酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD公司)，CO2培養(yǎng)箱(丹麥HETO公司)，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)。

2 方法

2.1 GLP的提取及含量測(cè)定

圖1顯示，分別稱取去皮和不去皮北沙參根250g，采用文獻(xiàn)法［5］分別制得去皮北沙參粗多糖(GLP1)和不去皮北沙參粗多糖(GLP2)，檢測(cè)GLP1和GLP2含量分別為63.88%和47.17%。

圖1 去皮和不去皮加工GLP的含量測(cè)定

2.2 動(dòng)物分組及給藥

小鼠64只隨機(jī)分為正常對(duì)照組(生理鹽水20 mL/kg)、模型組(生理鹽水20 mL/kg)、GLP1高劑量組(800mg/kg)、GLP1中劑量組(600 mg/kg)、GLP1低劑量組(400 mg/kg)、GLP2高劑量組(800 mg/kg)、GLP2中劑量組(600 mg/kg)、GLP2低劑量組(400mg/kg)8組，每組8只。每日上午除正常對(duì)照組灌服生理鹽水外，其余各組均灌胃給予甲狀腺素片150 mg/kg和利血平1 mg/kg，下午GLP各劑量組分別灌胃給予受試藥物，連續(xù)6d，各組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前后各稱量體質(zhì)量1次，計(jì)算體質(zhì)量增加值并觀察其外觀變化。

2.3 檢測(cè)各組小鼠脾臟NK細(xì)胞殺傷活力

將各組動(dòng)物于給藥后第7天處死，取脾臟組織制備脾細(xì)胞懸液，參照文獻(xiàn)［6］采用MTT比色法檢測(cè)各組小鼠NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率(%)。

2.4 檢測(cè)各組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能

將各組小鼠給藥后第7天處死，取脾臟組織制備脾細(xì)胞懸液，參照文獻(xiàn)［6］采用MTT比色法檢測(cè)各組小鼠刺激指數(shù)(SI)。

2.5 檢測(cè)各組小鼠血清抗綿羊紅細(xì)胞抗體IgM含量

將各組小鼠給藥后第7天處死，取小鼠血清，參照文獻(xiàn)［6］采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)檢測(cè)抗綿羊紅細(xì)胞抗體IgM的含量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采取兩均數(shù)比較t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 GLP1、GLP2滋陰作用的整體效應(yīng)觀察

表1顯示，小鼠給予甲狀腺素和利血平造模4 d后，開(kāi)始出現(xiàn)體質(zhì)量減輕、身體瘦長(zhǎng)、躁動(dòng)不安，部分出現(xiàn)兩眼不張、行動(dòng)遲緩甚至死亡。GLP1和GLP2各劑量組動(dòng)物各種虛象較輕，正常對(duì)照組動(dòng)物外觀和行為均正常。模型組動(dòng)物體質(zhì)量增加值顯著低于正常對(duì)照組，GLP1和GLP2各劑量組的體質(zhì)量增加顯著高于模型組，表明陰虛動(dòng)物體質(zhì)量降低，而GLP1和GLP2均能顯著增加其體質(zhì)量且呈量效關(guān)系，其中GLP1和GLP2高劑量組接近正常水平，2種北沙參粗多糖(GLP1、GLP2)各同劑量之間的作用比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3.2 GLP1、GLP2對(duì)模型小鼠脾臟NK細(xì)胞殺傷活力的影響

表1顯示，模型小鼠脾臟NK細(xì)胞殺傷活力明顯低于正常對(duì)照組(P＜0.01)，GLP1和GLP2的高劑量組均可顯著提高陰虛小鼠的NK殺傷率(P＜0.05)，接近正常值。2種北沙參粗多糖(GLP1、GLP2)同劑量之間的作用比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3.3 GLP1、GLP2對(duì)模型小鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

表1顯示，小鼠造模后，其刺激指數(shù)明顯降低(P＜0.01)，GLP1和GLP2高、中劑量組對(duì)陰虛小鼠的脾臟T細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能均有顯著增強(qiáng)的作用(P＜0.01，P＜0.05)，接近正常水平。2種北沙參粗多糖(GLP1、GLP2)各同劑量之間的作用比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3.4 GLP1、GLP2對(duì)模型小鼠血清抗綿羊紅細(xì)胞抗體IgM含量的影響

表2顯示，模型小鼠血清IgM抗體水平與正常組比較明顯降低(P＜0.05)，2種北沙參多糖的中劑量和低劑量組對(duì)IgM抗體的生成有顯著增強(qiáng)作用(P＜0.05)。2種北沙參粗多糖(GLP1、GLP2)的各同劑量之間的作用比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

4 討論

經(jīng)調(diào)查，北沙參沸水燙后去皮的加工方法距今已有二三百年的生產(chǎn)加工歷史。目前北沙參加工方法只是在民間使用，并沒(méi)有經(jīng)科學(xué)驗(yàn)證。去皮的原因和目的，一般認(rèn)為一是為了外觀好看，去皮北沙參外表黃白色，像生曬人參一樣;二是減少氣味;三是不易生蟲(chóng)。1960年衛(wèi)生部藥政局復(fù)湖北商業(yè)廳中西藥管理處的電文中指出:“北沙參可不刮皮使用?！苯?jīng)研究證明，北沙參帶皮使用可提高療效，并可省工省時(shí)、減少因加工造成的藥材損失，這在《中華人民共和國(guó)藥典》1990年版及以后的各版藥典中均有記載［7］。李峰等［8］也證實(shí)，在北沙參的醇溶性浸出物和水溶性浸出物中，去皮北沙參與帶皮北沙參的浸出物含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明“去皮”對(duì)北沙參浸出物含量無(wú)明顯影響。因此2010版《中華人民共和國(guó)藥典》收錄北沙參項(xiàng)下既保留了這種傳統(tǒng)的加工方法，又提出不去外皮的產(chǎn)地加工方法，即洗凈直接干燥后使用［9］。

表1 GLP干預(yù)對(duì)各組小鼠體質(zhì)量變化和各項(xiàng)免疫功能指標(biāo)的影響(±s)

表1 GLP干預(yù)對(duì)各組小鼠體質(zhì)量變化和各項(xiàng)免疫功能指標(biāo)的影響(±s)

注:與模型組比較:＊＊P＜0.01，*P ＜0.05;與正常組比較:△P＜0.05

組別 例數(shù) 給藥劑量/(mg/kg) 體質(zhì)量增加值/g NK細(xì)胞殺傷率(%)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化指數(shù)(SI) IgM(lgR)正 常 對(duì) 照 組 8 5.25±1.04＊＊ 30.01±0.05＊＊ 2.30 ±0.58＊＊ 4.10±0.02*陰 虛 模 型 組 8 2.57±1.07 18.73±0.03 1.08±0.15 3.60±0.04模 型 +GLP 1高 劑 量 組 7 800 4.71±1.11＊＊ 27.52±0.44＊＊ 1.67±0.36＊＊ 4.05±0.03模 型 +GLP 1中 劑 量 組 8 600 3.75±0.89* 22.10±0.09 1.46±0.32＊＊ 3.35±0.05＊△模 型 +GLP 1低 劑 量 組 7 400 3.43±1.40 20.47±0.17 1.03±0.18 3.15±0.03＊△模 型 +GLP 2高 劑 量 組 8 800 4.03±1.30＊＊ 25.6±0.02＊＊ 1.39±0.20＊＊ 3.95±0.02模 型 +GLP 2中 劑 量 組 8 600 3.89±0.99* 20.89±0.06 1.24±0.07* 3.25±0.05＊△模 型 +GLP 2低 劑 量 組 8 400 3.00±1.20 21.57±0.11 1.02±0.17 3.10±0.02＊△

文獻(xiàn)記載，北沙參可增強(qiáng)細(xì)胞免疫、體液免疫功能［10～12］。本實(shí)驗(yàn)分別從去皮加工北沙參和未去皮加工北沙參的根藥材中提取粗多糖GLP1和GLP2，觀察其對(duì)陰虛癥小鼠免疫功能的影響。結(jié)果表明，GLP1和GLP2均可使陰虛小鼠體質(zhì)量顯著增加;顯著增強(qiáng)甲亢型陰虛小鼠脾臟NK細(xì)胞殺傷率和T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能，提高血清IgM含量，且2種北沙參粗多糖(GLP1、GLP2)各相同劑量組之間的作用比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說(shuō)明北沙參的加工過(guò)程可省略“去皮”這道工序。

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