不同溶解液對(duì)CYP1B1432密碼子PCR引物穩(wěn)定性的影響

國玉芝，荊洪英，張志國，田 寅

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154003)

引物是所有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaetion，PCR)中必須使用的主要材料之一，引物的穩(wěn)定性對(duì)PCR的結(jié)果有著重要影響，可以說是決定PCR成敗的關(guān)鍵因素，而不同的引物溶解溶液對(duì)引物的穩(wěn)定性有著重要影響，我們?cè)谶M(jìn)行CYP1B1432密碼子(rs1056836)的PCR中就遇到了該問題。對(duì)于引物的穩(wěn)定性，多數(shù)文獻(xiàn)[1，2]從引物長度，解鏈溫度(Tm)引物序列，引物二聚體及引物自由能等方面考慮，而沒有見到關(guān)于引物溶解溶液對(duì)于引物穩(wěn)定性的報(bào)道，因而我們使用常用的引物溶解溶液滅菌雙蒸水，滅菌去離子水和10mM三羥甲基氨基甲烷－乙二胺四乙酸緩沖液(Tris－EDTA，TE)溶解引物，通過PCR后電泳條帶的亮度與脫氧核糖核酸梯狀標(biāo)志(DNA Ladder Marker)亮度的比較確定PCR效果，并將PCR產(chǎn)物進(jìn)行了電泳和酶切后電泳的方法考察了引物的穩(wěn)定性，結(jié)果表明使用去離子水和TE作為引物的溶解溶液較好，而使用滅菌雙蒸水效果較差。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

S1000 Thermal Cycler PCR儀(美國 Bio－Rad公司);PowerPac Universal通用型電泳儀(美國 Bio－Rad公司);ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio－Rad公司);H2500R－2高速冷凍離心機(jī)(上海滬譽(yù)貿(mào)易有限公司)。

1.1.2 試藥

Genomic DNA Purification Kit、Maxima Hot Start Green PCR Master Mix(2X)、Gene Ruler 100 bp DNA Ladder，Oli I內(nèi)切酶，F(xiàn)ermentas公司生產(chǎn);Gelred染色劑由BIOTIUM公司生產(chǎn);CYP1B1432密碼子PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;滅菌雙蒸水，天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司生產(chǎn)，滅菌去離子水由本院制劑室生產(chǎn);TE自行配制。

1.2 方法

1.2.1 引物配制及試驗(yàn)方法

參考有關(guān)文獻(xiàn)[3]使用引物序列為Forward Primer:5＇……ATGCGCTTCTCCAGCTTTGT……3 ＇，Reverse Primer:5 ＇……TATGGAGCACACCTCACCTG……3＇，PCR 產(chǎn)物長度 623bp。取F、R引物各6支，每支1.0 OD，分為3組，每組上下引物各兩支，第1組使用滅菌雙蒸水(pH6.0);第2組使用滅菌去離子水(pH7.5);第3組使用 TE(pH7.5)溶解配制成100μmol·L－1的引物，置－20℃冰箱保存;次日每組各取1支室溫下融化，使用相應(yīng)的溶解液稀釋成10μmol·L－1的引物，每組引物分裝為4支，置－20℃冰箱保存，分別于第1～4周的周一開始連續(xù)5d進(jìn)行PCR試驗(yàn);100μmol·L－1引物分別于第2、第4、第6和第8個(gè)月取適量使用相應(yīng)的溶劑稀釋成10μmol·L－1并于每月的第一天連續(xù)做5d PCR試驗(yàn)。

1.2.2 PCR、酶切及電泳

PCR體系為Maxima Hot Start Green PCR Master Mix(2X)12.5μL，ddH2O 8.5μL，F(xiàn)、R primer各 1.0μL，血液 DNA 2.0μL。PCR條件為95℃預(yù)變性及酶激活4min;95℃變性30s，56℃退火 30s，72℃ 延伸 30s，共 35 個(gè)循環(huán);72℃ 末延伸5min。酶切體系為 10 ×green buffer 2μL，Oli I內(nèi)切酶 1μL，ddH2O 17μL，PCR 產(chǎn)物 10μL;酶切條件:水浴 37℃ 酶切10min，然后取出立即置水浴65℃滅活5min。使用經(jīng)Gelred染色的2%瓊脂糖凝膠電泳45min，電壓145V。電泳結(jié)束把凝膠從膠板上取出，放到凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果并拍照。

2 結(jié)果

分別取引物按2.1項(xiàng)的時(shí)間和2.2 PCR體系與方法進(jìn)行PCR，100bp DNA Ladder與 PCR產(chǎn)物分別點(diǎn)樣5μL，酶切產(chǎn)物點(diǎn)樣8μL進(jìn)行電泳。結(jié)果判斷:當(dāng)PCR產(chǎn)物亮度大于或等于600bp Ladder時(shí)，判定陽性(+);當(dāng)亮度小于600bp Ladder或條帶顯示不清時(shí)，判定為陰性(－)(此時(shí)酶切后可能會(huì)無法顯色)。PCR及酶切產(chǎn)物典型電泳圖如圖1，10μmol·L－1和 100μmol·L－1引物 PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果如表1、表2。

圖1 CYP1B1432密碼子PCR產(chǎn)物及酶切后典型電泳圖

表1 10μmol·L－1引物使用時(shí)間及PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

由表1的結(jié)果可見:雙蒸水溶解的10μmol·L－1引物第1周可以凍融5次，第2周可以凍融2次;第3周擴(kuò)增電泳后沒有出現(xiàn)PCR產(chǎn)物條帶;去離子水和TE溶解的10μmol·L－1引物第1周和第2周可以凍融5次，第3周可以凍融4次，第4周尚可以凍融3次。

表2 100μmol·L－1引物稀釋使用時(shí)間及PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

由表2可見，雙蒸水配制的100μmol·L－1引物在－20℃保存兩個(gè)月時(shí)稀釋只能凍融2次，到第四個(gè)月時(shí)使用稀釋引物擴(kuò)增電泳后沒有出現(xiàn)PCR產(chǎn)物條帶;去離子水和TE溶解的100μmol·L－1引物－20℃可以保存8個(gè)月，但在保存8個(gè)月時(shí)稀釋只可以凍融2次。

3 討論

在“生工生物工程(上海)股份有限公司”(引物合成單位)網(wǎng)站上(http://www.sangon.com/sangon_detail.aspx)如何溶解并保存引物項(xiàng)標(biāo)注引物溶解使用滅菌雙蒸水或10mM TE緩沖液(pH 7.5～8.0)溶解。在實(shí)際工作中，溶解引物的溶劑有滅菌雙蒸水、滅菌去離子水、TE緩沖液等。本文使用的溶解溶劑經(jīng)過pH值檢測，滅菌雙蒸水pH值為6.0，滅菌去離子水和TE緩沖液pH值為7.5。本文試驗(yàn)中表明使用滅菌雙蒸水溶解的 10μmol·L－1和 100μmol·L－1引物 PCR效果不好，其原因可能是和其pH值較低有關(guān)，引物雖然是小分子單鏈DNA，但其同樣具有DNA的性質(zhì)，DNA在弱酸性條件下不如在弱堿性條件下穩(wěn)定，在弱酸性條件下很快降解了，所以PCR效果不如其他兩種溶劑溶解的引物PCR效果好。使用滅菌去離子水和TE緩沖液作為溶解液較好，其新溶解的10μmol·L－1引物工作液可以耐受1周內(nèi)的5次和2周內(nèi)的5次凍融;在4周和5周時(shí)尚可以耐受4次和3次凍融試驗(yàn)，在保存2周后，耐受凍融次數(shù)明顯減少，所以，10μmol·L－1引物保存時(shí)間最好不要超過2周。使用滅菌去離子水和TE配制的100μmol·L－1在－20℃保存4個(gè)月時(shí)稀釋，可以耐受5天內(nèi)5次凍融，在保存6個(gè)月時(shí)稀釋，尚可耐受4次凍融，保存8個(gè)月時(shí)稀釋，可以耐受2次凍融試驗(yàn)。為保證PCR效果，100μmol·L－1引物保存期以 －20℃6個(gè)月為好。由本實(shí)驗(yàn)也可以得知，100μmol·L－1引物較 10μmol·L－1引物穩(wěn)定，在－20℃保存期可以達(dá)到6個(gè)月。但由于TE緩沖液含有絡(luò)合劑EDTA，使用時(shí)會(huì)絡(luò)合PCR混合液中的Mg2+，其作為引物的溶解液應(yīng)該嚴(yán)格控制其濃度，以避免影響PCR效果。為了證明引物穩(wěn)定性試驗(yàn)的可靠性，本文使用保存6個(gè)月的引物作了PCR試驗(yàn)并進(jìn)行酶切，結(jié)果三種基因型條帶顯示清楚，滅菌去離子水和TE配制的引物可以在PCR實(shí)踐中應(yīng)用。

[1]李金明.實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)[M].北京:人民軍醫(yī)出版社，2007，5-7

[2]靜國忠.基因工程及分子生物學(xué)基礎(chǔ)[M].北京:北京大學(xué)出版社，1999，195-198

[3]Trubicka J，Grabowska Klujszo E，Suchy J，et al.Variant alleles of the CYP1B1 gene are associated with colorectal cancer susceptibility[J].BMC Cancer，2010，10:420