LPS誘導人腎小球系膜細胞FoxM1B分子表達的研究

陳偉強，魏鳳香，潘德順，辛 華，王 莉，王 琳

（1.廣東藥學院基礎學院，廣東 廣州510006；2.深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院中心實驗室，廣東 深圳518000；3.廣東藥學院藥科學院，廣東 廣州510006；4.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯154003）

腎臟系膜細胞（MCs）過度增殖而導致腎小球硬化（GS），引起腎單位結構和功能破壞，最終發(fā)展為慢性腎衰竭。GS是多種生物活性物質和細胞成分參與的復雜過程，腎臟局部和機體系統(tǒng)的內環(huán)境改變都可以影響其發(fā)生發(fā)展，其中MCs在炎癥的剌激下過度增殖是其主要病理基礎[1]。脂多糖（1ipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性菌細胞壁的組成成分，為重要的炎癥反應觸發(fā)劑，并誘導多種細胞因子參與炎癥反應。FoxM1B屬于叉頭框（forkhead box，F(xiàn)ox）蛋白家族成員之一，是與細胞增殖有關的特異性轉錄因子。LPS可刺激腎臟系膜細胞增生和基質合成，但其作用是否與FoxM1B表達變化相關，目前不十分清楚。本實驗通過脂多糖（LPS）模擬炎癥過程，觀察腎小球系膜細胞增殖、FoxM1B分子表達的變化，以探討LPS誘導人腎小球系膜細胞增生的可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料

脂多糖（LPS，Sigma公司）；RPMI一1640、Trizol RNA提取試劑盒、PCR試劑盒購自Amresco公司。新生小牛血清（FCS）為杭州四季青生物工程材料研究所提供。

1.2 系膜細胞培養(yǎng)

以含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基，于37℃、飽和濕度下、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞呈單層貼壁生長，2～3d傳代一次。取對數(shù)生長期細胞。

1.3 實驗分組

①對照組，細胞不作任何處理；②LPS（10μg／mL）處理12h組；③LPS（10μg／mL）處理24h組；④LPS（10μg／mL）處理48h組。

1.4 細胞增殖水平檢測

取培養(yǎng)系膜細胞胰蛋白酶消化，加RPMI－1640完全培養(yǎng)液于離心管中，吹打混勻，按每孔200μL，密度103／mL接種于96孔板。待細胞貼壁24h后，換5%血清培養(yǎng)液200μL，同步24h。再按上述分組孵育，刺激時間為12、24、48h。置37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)，加人噻唑藍（MTT），于4h后分別加人二甲基亞礬（DMSO），酶標儀620nm波長處記錄吸光度值（D值）。

1.5 qRT－PCR法檢測不同細胞處理組FoxM1BmRNA含量

不同處理組系膜細胞，加入TRIzol試劑裂解提取總RNA。用逆轉錄試劑盒以Oligo（dT）將總RNA逆轉成cDNA。反應條件：42℃20min、99℃5min、4℃5min。以cDNA作為模板通過qRT—PCR法檢測細胞中FoxM1BmRNA的含量，反應條件：95℃3min、95℃30S、65℃30S、72℃30S；擴增45個循環(huán)。以β－肌動蛋白作為內參，用ΔΔCt法進行結果分析。FoxM1B及β－肌動蛋白熒光定量PCR引物由本室設計。并由上海生物工程有限公司合成。FoxM1B上游引物：5’ATGAAAACTACCCCCGTC3’，下游引物：5’TGGGGTGGTTAATAACTTGG3’。β－肌動蛋白上游引物：5’CCAGC－CTTCCTTCTTGGGTAT3’，下 游 引 物：5’TTGGCATAGAGGTCTTACGG 37。

1.6 蛋白質印跡法（western blotting）檢測

細胞處理后，用0.5%胰蛋白酶消化，4℃PBS漂洗3次，加入600μL細胞裂解液（2×106個細胞，內含磷酸酶抑制劑），置冰上30min后，4℃、15000×g離心30min，上清液即為總的細胞蛋白溶解成分。上清液加等量2倍十二烷基硫酸鈉上樣緩沖液在十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后電轉膜到醋酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉，以兔抗人（1：5000）為一抗，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（1：500）為二抗進行抗原抗體反應，發(fā)光試劑盒顯色。Alphalmager2200圖像系統(tǒng)分析灰度值，取β－肌動蛋白灰度值的比值進行統(tǒng)計學分析[2]。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 LPS誘導系膜細胞增殖的結果

用MTT方法檢測。與對照組相比，在12、24、48h，10μg／mL的LPS能促進MCs增殖。結果見表1。

表1 LPS誘導的MCs增生（±s，n＝10）

表1 LPS誘導的MCs增生（±s，n＝10）

注：＊與正常對照組比較，P＜0.05。

組 別 12h 24h 0.27±0.02 0.31±0.04 0.38±0.03 LPS組 0.39±0.02＊ 0.48±0.03＊ 0.64±0.0448h正常對照組＊

2.2 兩組細胞FoxM1BmRNA的水平

采用qRT－PCR法檢測兩組細胞FoxM1BmRNA的含量.以對照組mRNA水平為基礎，LPS處理組mRNA水平用對照組的倍數(shù)來表示；結果顯示：LPS處理細胞FoxM1B mRNA水平明顯高于對照組（P＜0.001）。結果見圖1。

圖1 對照組和LPS處理組細胞FoxM1BmRNA水平

2.3 LPS對人系膜細胞FoxM1B蛋白表達的影響

FoxM1B和β－肌動蛋白灰度值的比值見表2、圖2。

表2 LPS對MCs FoxM1B表達的影響（±s，n＝10）

表2 LPS對MCs FoxM1B表達的影響（±s，n＝10）

注：＊與正常對照組比較，P＜0.01。

組別 12h 24h 0.13±0.01 0.17±0.02 0.16±0.02 LPS組（FoxM1B／β－actin） 0.45±0.02＊ 0.63±0.03＊ 0.74±0.0448h正常對照組（FoxM1B／β－actin）＊

圖2 LPS對MCs FoxM1B表達的影響

3 討論

腎小球內MC增生和細胞外基質增多是多種腎小球疾病、腎小球毀損、硬化過程中的主要表現(xiàn)[3]。MC屬于血管周細胞，是反應活躍的腎小球固有細胞，在炎癥過程中不但是被動受害者，而且是直接參與者。我們發(fā)現(xiàn)：LPS能明顯誘導系膜細胞的增殖，這與以前的報道是一致，目前認為：其作用機制與LPS調節(jié)多種炎癥和細胞生長因子相關[4]。叉頭框（forkhead box，F(xiàn)ox）蛋白家族是一類DNA結合區(qū)具有翼狀螺旋結構的轉錄因子，目前已發(fā)現(xiàn)17個亞族。Foxm1屬Fox轉錄因子的一個亞型，根據(jù)轉錄后不同的剪切形式又分為A、B、C三個亞型。其中FoxM1B與細胞增殖密切相關。FoxM1B可見于所有胚胎組織及正在擴增的細胞中，終末分化細胞及靜止期細胞中幾乎沒有表達，但是當靜止期細胞再次進入細胞周期時則又恢復高水平表達。成年組織中僅在胸腺及睪丸中高表達（由于此兩種器官中存在活躍的細胞增殖過程），在正常肝臟中的表達水平很低，若部分切除肝臟后，由于殘留肝細胞重新進入分裂周期，其表達水平又可見明顯增加，此外在許多腫瘤組織及腫瘤細胞系中均有表達。因此，多數(shù)學者認為FoxM1B是與細胞增殖密切相關的特異性轉錄因子。FoxM1B的表達受c－Myc和核轉錄因子E2F的調控。細胞進入有絲分裂前c－Myc和E2F表達增高，二者可以結合在FoxM1b啟動子區(qū)，上調FoxM1B的表達，進而促進細胞有絲分裂。研究證實FoxM1B的表達水平及其活性在G1末期即明顯升高，且一直持續(xù)到有絲分裂完成。FoxM1B通過調控下游靶基因促進細胞分裂，目前已發(fā)現(xiàn)的20多個FoxM1B靶基因幾乎都與細胞周期及分裂增殖有關，如FoxM1B可以促進cyclins和CDKs的表達。同時，cyclins及CDKs又可促進FoxM1B的磷酸化水平，一方面增強其轉錄活性，另一方面有助于其向核內轉移[3]。我們研究發(fā)現(xiàn)：正常培養(yǎng)的系膜細胞僅能表達極微量FoxM1b，這與其它的研究結果是一致的，而LPS在誘導系膜細胞增生同時，能明顯誘導FoxM1b表達增加，表明FoxM1B與LPS誘導的MCs增殖可能有關；但其詳細的作用機制需要進一步的實驗加以探討。我們的研究結果將有助于進一步確認FoxM1B在MCs過度增殖從而引發(fā)腎小球硬化及腎單位損害中的作用，為延緩乃至阻止腎單位的進行性破壞提供新的生物治療靶點。

[1]Picken MM.The role of mesangial homeostasis in glomerular injury progression：hope for mesangial sclerosis reversal[J].Kidney Int，2009，5（6）：574－576

[2]潘德順，陳偉強.苯丁酸鈉對人舌鱗癌Tca8113細胞株p21和survivin基因表達的影響[J].中國藥理學通報，2010－02－20

[3]Wang JL，Cheng HF.A selective cyclooxygenase－2inhibitor decreases protein uria and retards progressive renal injury in rats[J].Kidney International，2000，57（6）：2334－2342

[4]Lee IT，Shih RH，Lin CC，et al.Role of TLR4／NADPH oxidase／ROS－activated p38MAPK in VCAM－1expression induced by lipopolysaccharide in human renal mesangial cells[J].Cell Commun Signal，2012，10（1）：33－38