依帕司他治療糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠的療效評(píng)價(jià)

鄔 磊,劉鵬鷹

(廣東省深圳市第二人民醫(yī)院綜合科,廣東深圳,518035)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)是糖尿病常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一,病變可累及全身運(yùn)動(dòng)神經(jīng)、感覺(jué)神經(jīng)及自主神經(jīng)等系統(tǒng),且難以逆轉(zhuǎn)[1-2]。依帕司他是一種新型的醛糖還原酶抑制劑,研究[3-5]表明其可以減輕糖尿病大鼠神經(jīng)纖維的滲出、水腫,亦有報(bào)道[6]稱其可以縮短糖尿病患者正中神經(jīng)和脛神經(jīng)運(yùn)動(dòng)纖維最小F波潛伏期。本研究采用鏈脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型,而后給予依帕司他治療并評(píng)價(jià)其療效,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SD雄性大鼠80只,8周齡,體質(zhì)量170～220 g(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。試劑:鏈脲佐菌素(STZ)(美國(guó)Sigma公司,批號(hào)S-0130);依帕司他(中國(guó)揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán),批號(hào)國(guó)藥準(zhǔn)字H20040012);cAMP、cGMP放射免疫分析試劑盒(上海中醫(yī)藥大學(xué)同位素室,批號(hào)200710);超微量ATP酶測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所,批號(hào) 20090516);還原型輔酶Ⅱ(NADPH)測(cè)試盒(北京恒奧生物科技有限公司,批號(hào)10621692001)。儀器:Neuromatic 2000M/C肌電圖機(jī)(丹迪公司);VC-10雙道記憶示波器(日本光電公司);Bionime Rightest GM300血糖儀;MPF-4型熒光分光光度計(jì)(日立公司);SN-697型放射免疫γ計(jì)數(shù)器(上海核所日環(huán)光電儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,禁食不禁水12 h,按體質(zhì)量層次隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=20)和造模組(n=60)。STZ溶于0.1 mmol/L的枸櫞酸鈉緩沖液(pH 4.5)中,按60 mg/kg的劑量一次性腹腔注射,72 h后由尾靜脈采血測(cè)定血糖,以血糖值≥16.7 mmol/L為造模成功的糖尿病大鼠[7]。選取40只造模成功的大鼠并隨機(jī)分為模型對(duì)照組和依帕司他治療組,每組20只。依帕司他治療組按100 mg/(kg·d)給藥,模型對(duì)照組給予生理鹽水2 mL/d,連續(xù)給藥8周。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 一般指標(biāo)監(jiān)測(cè):采取動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的方式,從大鼠糖尿病形成至實(shí)驗(yàn)結(jié)束(8周),測(cè)定體質(zhì)量,尾靜脈取血測(cè)定血糖,1次/2周。

1.3.2 坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度測(cè)定[8]:測(cè)定坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度(MNCV),用10%水合氯醛將大鼠麻醉,俯臥位固定,刺激電極置于坐骨結(jié)節(jié)處坐骨神經(jīng)傳出部位,記錄電極置于踝關(guān)節(jié)坐骨神經(jīng)經(jīng)過(guò)處,用2個(gè)針電極經(jīng)皮插入,電極間距為2 mm,接地于尾部,用方形波(10～ 20 mA,40 μ s脈波寬)刺激神經(jīng),用2個(gè)針電極在同側(cè)的足部骨間肌記錄復(fù)合肌肉動(dòng)作電位。記錄3對(duì)不同的M波潛伏期,取其平均值。近端和遠(yuǎn)端的潛伏期差值作為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)在2個(gè)刺激部位間的傳導(dǎo)時(shí)間,再測(cè)量出2個(gè)刺激部位間的距離。MNCV=刺激電極與記錄電極間的距離/潛伏期差值。

1.3.3 感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度測(cè)定:測(cè)定感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(SNCV),用10%水合氯醛將大鼠麻醉,俯臥位固定,刺激電極置于坐骨結(jié)節(jié)處坐骨神經(jīng)傳出部位,記錄電極置于踝關(guān)節(jié)坐骨神經(jīng)經(jīng)過(guò)處,用2個(gè)針電極經(jīng)皮插入,電極間距為2 mm接地于尾部,用方形波(2 mA,40 μ s脈波寬)記錄6對(duì)坐骨窩和踝激發(fā)的H反射潛伏期,取最短的潛伏期差值,再測(cè)量出2個(gè)刺激部位間的距離。SNCV=刺激電極與記錄電極間的距離/潛伏期差值。

1.3.4 坐骨神經(jīng)中醛糖還原酶(AR)活性、Na+-K+-ATP酶活性測(cè)定[9]:取大鼠坐骨神經(jīng),冷生理鹽水沖洗、稱重后,加入1.5 mL的冷生理鹽水勻漿,勻漿液0℃～4℃條件下3 500 r/min離心15 min,所得上清液以熒光分光光度法進(jìn)行AR活性測(cè)定。Na+-K+-ATP酶活性測(cè)定采用超微量ATP酶測(cè)試盒,嚴(yán)格依照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.5 坐骨神經(jīng)中 cAMP、cGMP含量的測(cè)定[10]:將大鼠麻醉成功后,分離出坐骨神經(jīng),在冰浴環(huán)境中將坐骨神經(jīng)放入盛有2mL冷的0.05 mmoL醋酸緩沖液(pH 4.75)的勻漿器內(nèi),組織粉碎后將懸浮液倒入10mL試管內(nèi),用2 mL無(wú)水乙醇洗勻漿器,然后將乙醇倒入懸浮液中混勻并靜置5 min,3 000 r/min離心15 min后,將上清液收集在小瓶?jī)?nèi)。用2 mL 75%乙醇洗勻漿器和沉淀2次,混勻3000 r/min離心15 min后,合并上清液,60℃水浴中吹干,殘?jiān)?℃保存。用1 mL醋酸緩沖液溶解殘?jiān)?,取0.1 mL樣本與乙酸化試劑5 IU,125I cAMP標(biāo)準(zhǔn)或者125I cGMP標(biāo)準(zhǔn)100 IU,抗血清100 IU混勻,4℃存放過(guò)夜后,再向其中加入正常兔血清100 IU。羊抗兔血清100 IU,混勻,4℃存放過(guò)夜。3 000 r/min離心15 min后,負(fù)壓吸去上清液,再用SN-697型放射免疫γ計(jì)數(shù)器進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量及血糖變化比較

造模前各組大鼠體質(zhì)量、血糖無(wú)顯著差異(P>0.05);造模后2、8周,模型對(duì)照組及依帕司他組大鼠體質(zhì)量明顯低于正常對(duì)照組(P<0.01),血糖則顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01);依帕司他組治療前后血糖無(wú)明顯降低(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 3組大鼠坐骨神經(jīng)MNCV、SNCV變化比較

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2、8周后,模型對(duì)照組大鼠坐骨神經(jīng)MNCV、SNCV較正常對(duì)照組明顯減慢(P<0.01),依帕司他組MNCV、SNCV則有顯著提高。見(jiàn)表2。

2.3 3組大鼠坐骨神經(jīng)AR活性、Na+-K+-ATP酶活性、cAMP及cGMP含量比較

與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組AR活性顯著升高(P<0.01),Na+-K+-ATP酶活性顯著降低(P<0.01);依帕司他組AR活性較模型對(duì)照組顯著降低(P<0.01),Na+-K+-ATP酶活性顯著升高(P<0.01)。模型對(duì)照組坐骨神經(jīng)中cAMP、cGMP的含量顯著低于正常對(duì)照組(P<0.01),依帕司他組cAMP、cGMP含量顯著高于模型對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表1 3組大鼠體質(zhì)量及血糖變化比較( ±s)

表1 3組大鼠體質(zhì)量及血糖變化比較( ±s)

與正常對(duì)照組比較,＊＊P<0.01。

組別 n體質(zhì)量/g 2周 8周血糖/(mmol/L)2周 8周正常對(duì)照組 20 197.5±8.6 196.8±12.7 9.35±1.36 9.59±1.38模型對(duì)照組 20 132.9±7.4＊＊ 130.4± 6.5＊＊ 18.27±1.07＊＊ 18.76±1.02＊＊依帕司他組 20 130.1±8.3＊＊ 129.6± 6.8＊＊ 18.86±1.12＊＊ 19.08±1.04＊＊

表2 3組大鼠坐骨神經(jīng)MNCV、SNCV變化比較( ±s)cm/s

表2 3組大鼠坐骨神經(jīng)MNCV、SNCV變化比較( ±s)cm/s

與正常對(duì)照組比較,＊P<0.05,＊＊P<0.01;與模型對(duì)照組比較,##P<0.01。

組別 n M NCV 2周 8周SNCV 2周 8周正常對(duì)照組 20 48.34±1.23 48.89±1.45 40.05±1.23 39.51±1.39模型對(duì)照組 20 42.43±2.09＊＊ 42.95±0.99＊＊ 2.15±1.73＊＊ 32.36±2.06＊＊依帕司他組 20 47.46±1.25＊## 48.04±0.97＊## 38.37±1.45＊## 38.31±1.19＊##

表3 3組大鼠坐骨神經(jīng)AR活性、Na+-K+-ATP酶活性、cAMP、cGMP變化比較( ±s)

表3 3組大鼠坐骨神經(jīng)AR活性、Na+-K+-ATP酶活性、cAMP、cGMP變化比較( ±s)

與正常對(duì)照組比較,＊P<0.05,＊＊P<0.01;與模型對(duì)照組比較,#P<0.05,##P<0.01。

組別 n AR活性/(U/mg)Na+-K+-ATP 酶活性/[μ moL/(mg·h)]cAMP cGMP正常對(duì)照組 20 9.33±0.83 0.970±0.067 57.21±3.58 47.38±3.22模型對(duì)照組 20 11.48±1.66＊＊ 0.804±0.091＊＊ 51.87±3.32＊＊41.67±2.59＊＊依帕司他組 20 10.19±0.81＊＊## 0.905±0.085＊## 54.83±3.52＊#43.96±3.10＊＊#

3 討 論

目前,DPN的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,本研究發(fā)現(xiàn)DPN大鼠坐骨神經(jīng)MNCV、SNCV較正常對(duì)照組明顯減慢,說(shuō)明其存在周圍神經(jīng)損害。生理狀態(tài)下,葡萄糖大部分被己糖激酶磷酸化,通過(guò)糖酵解和三羧酸循環(huán)為人體提供能量,僅少量非磷酸化葡萄糖進(jìn)入多元醇代謝通路。AR是多元醇通路的限速酶,能將葡萄糖轉(zhuǎn)化為山梨醇。高血糖狀態(tài)下,AR則被過(guò)度激活,造成細(xì)胞內(nèi)山梨醇和果糖聚積[11-12]。依帕司他是一種新型醛糖還原酶抑制劑,能阻斷異?；钴S的多元醇旁路,增加細(xì)胞外肌醇進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),從而阻止或減緩糖尿病神經(jīng)病變[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)給予DPN大鼠依帕司他治療后,其坐骨神經(jīng)MNCV、SNCV減慢速度較模型對(duì)照組更為緩慢(P<0.01),與文獻(xiàn)[15]報(bào)道符合,說(shuō)明依帕司他對(duì)DPN大鼠坐骨神經(jīng)損害有治療作用。

本研究結(jié)果顯示,依帕司他治療前后血糖無(wú)明顯降低(P>0.05),說(shuō)明其對(duì)神經(jīng)病變的影響并非通過(guò)降低血糖而起作用。本研究還發(fā)現(xiàn)DPN大鼠坐骨神經(jīng)AR活性升高(P<0.01),Na+-K+-ATP酶活性降低(P<0.01),而依帕司他治療后則能降低AR活性(P<0.01),并升高Na+-K+-ATP酶活性(P<0.01),推測(cè)其可能的作用機(jī)制是:在高血糖狀態(tài)下,AR活性增強(qiáng),多元醇旁路激活導(dǎo)致細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶活性下降,有可能會(huì)導(dǎo)致大鼠坐骨神經(jīng)的靜息電位發(fā)生改變。依帕司他能恢復(fù)Na+-K+-ATP酶活性,使細(xì)胞處于超極化狀態(tài),進(jìn)而使細(xì)胞功能得到恢復(fù)。

作者還發(fā)現(xiàn)DPN大鼠坐骨神經(jīng)cAMP、cGMP的含量有下降(P<0.01),而依帕司他治療后cAMP、cGMP含量有升高(P<0.05),推測(cè)作為神經(jīng)傳導(dǎo)的第二信使cAMP、cGMP的含量減少會(huì)影響神經(jīng)信號(hào)傳遞,減慢神經(jīng)傳導(dǎo)速度,進(jìn)而引起神經(jīng)病變。依帕司他通過(guò)增加cAMP、cGMP的含量來(lái)改善DPN大鼠周圍神經(jīng)損害,但具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究探討。

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