豬瘟病毒陽性血清的熱加速穩(wěn)定性試驗

戴志紅，蔣 卉，李 翠，張秀英，溫 芳，陸連壽，孫海燕，魏 津，關(guān)孚時，王在時

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

豬瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一種高度接觸性、致死性的豬傳染病，在世界上很多國家(地區(qū))［1－2］包括我國［3－4］均有發(fā)生，給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將豬瘟列為法定通報性疫?。?］，我國將其劃為一類動物傳染病［6］，并納入重大動物疫病防控計劃。豬瘟病毒抗體檢測是豬瘟診斷、免疫效果評價和流行病學調(diào)查的重要手段，但其敏感度和準確性易受方法、人員、試劑、實驗動物等諸多因素影響。豬瘟病毒陰、陽性血清國家參考品則是控制和校準豬瘟抗體檢測的實物“標尺”，但我國目前尚缺乏豬瘟病毒陰、陽性血清國家參考品。為了研制該參照品，本研究對制備的1批豬瘟病毒陽性血清進行了熱加速穩(wěn)定性試驗，以考察凍干工藝與產(chǎn)品的貯存有效期是否符合預期。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 豬瘟病毒陽性血清 豬瘟病毒陽性血清，經(jīng)過濾分裝至1 mL長頸安瓿(每支分裝1 mL)，凍干、抽真空后熔封，計1000支，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備(批號200905－3)。

1．1．2 試劑 豬瘟抗體 ELISA檢測試劑盒(Lot No．43220－T761)，Idexx公司。

1．2 方法

1．2．1 試驗方案 采用經(jīng)典恒溫熱加速穩(wěn)定性實驗，從幾個較高溫度下樣品的效價失活情況計算其在較低溫度下的貯存有效期。隨機抽取40支血清樣品，分別在 25、37、45、56 ℃下保溫，分別于 0、1、2、3、4、8、12、24 周隨機抽取1 支樣品，按照 1 ∶400、1∶450～1∶800系列稀釋，每個稀釋度重復3孔，用豬瘟抗體ELISA檢測試劑盒檢測其效價(最大陽性稀釋倍數(shù))(注:盡量在同條件下、在同一酶標儀上檢測)。

1．2．2 不同溫度下的失活速率常數(shù)k的計算 大部分蛋白質(zhì)或生物制品的活性失活基本上都符合一級反應動力學［7－8］。一級反應的速率方程(公式1)為:ln c=ln c0－kt，式中的 c為效力值(或其他活性單位值)，c0為初始效力值，k為失活速率常數(shù)，t為時間。將不同溫度下的加速穩(wěn)定性數(shù)據(jù)按公式1擬合線性回歸方程，據(jù)此求出不同溫度下的k值。

1．2．3 －20℃下失活速率常數(shù)k的計算 不同溫度的失活速率常數(shù)k與溫度的動力學關(guān)系符合Arrhenius方程［9］(公式 2):ln k= － Ea/RT+ln A，T為絕對溫度，R為摩爾常數(shù)，Ea為活化能，A為指前因子。將25、37、45、56℃下失活速率常數(shù) k按公式2擬合出線性回歸方程，據(jù)此求出－20℃下的k值。

1．2．4 －20℃下貯存有效期的計算 根據(jù)－20℃下的失活速率常數(shù)k及公式1，即可計算出樣品效價由初始效價降低到目標效價所需的時間，即為該樣品的貯存有效期。

1．2．5 持續(xù)穩(wěn)定性監(jiān)測 隨機抽?。?0℃下保存1年后的制品5支，按1．2．1項方法測定其效價，以后每隔一定時間監(jiān)測一次。

2 結(jié)果

2．1 不同溫度下的熱加速試驗結(jié)果 血清在25、37、45、56℃時的熱加速試驗結(jié)果與預期相符，保存溫度越高，效價下降速度越快(表1)。

表1 不同溫度下的熱加速試驗結(jié)果

2．2 不同溫度下的失活速率常數(shù)k 將不同溫度下的熱加速穩(wěn)定性數(shù)據(jù)按公式1擬合出線性回歸方程(圖1)，結(jié)果R2值均大于0．95，相關(guān)性良好，得出了不同溫度下的k值。

2．3 －20℃下失活速率常數(shù)k 將25、37、45、56℃下失活速率常數(shù)k按公式2擬合出線性回歸方程(圖2)，據(jù)此求出 －20 ℃下的k值為5．874 ×10－5。

2．4 －20℃下的貯存有效期 根據(jù)－20℃下的失活速率常數(shù)k及公式1，計算出樣品效價由初始效價1∶800降低到95%(即1∶760)所需的時間為16．8 年。

2．5 持續(xù)穩(wěn)定性監(jiān)測 結(jié)果顯示，5支樣品的ELISA效價均為1∶800，制品活性未發(fā)生明顯下降，與熱加速穩(wěn)定試驗預期一致。

圖1 不同溫度下效價隨時間變化擬合線性回歸

圖2 不同溫度下k值擬合線性回歸

3 討論

通常在較低的保存溫度下(2～8℃或－20℃)生物制品的失活速度很慢，加之生物制品活性出現(xiàn)的細微下降不易被非常準確地測定，因此在較低溫度下，研究者往往很難在短時間內(nèi)(幾周以至幾個月)根據(jù)生物制品的失活數(shù)據(jù)和公式1得到比較準確的k值，從而計算制品在該溫度下的貯存有效期。而生物制品在較高溫度下的失活速度很快，利用Arrhenius方程和幾個溫度下的加速失活數(shù)據(jù)，則可以從較高溫度下的k值估算較低溫度下的k值，再根據(jù)k值和公式1預測制品在低溫保存條件下的穩(wěn)定性。因此，熱加速穩(wěn)定性試驗可以在較短時間內(nèi)比較準確地預測制品在某溫度下的貯存有效期。

3．1 熱加速溫度點的選擇 根據(jù)Arrhenius方程擬合線性回歸必須至少要有3個溫度點的k值，因此熱加速穩(wěn)定試驗選擇的溫度點要在3個以上。此外，要根據(jù)制品在幾個溫度點下的失活數(shù)據(jù)和公式1擬合線性回歸得到比較準確的k值，則需要科學選擇試驗的溫度點，要求溫度點之間有較大間隔并且制品在這些溫度點下失活速度較快而又不能過快，以保證擬合線性回歸的相關(guān)系數(shù)較好(一般要求R2≥0．95)。若溫度點間隔較小，則k值隨溫度變化不明顯，會導致擬合線性回歸不理想;若溫度太高以致失活太快，則該溫度下失活的有效數(shù)據(jù)太少，也會導致擬合線性回歸不理想。如擬合線性回歸失敗或不理想，可以適當調(diào)整試驗溫度。本試驗選擇25、37、45、56℃為溫度點，結(jié)果擬合線性回歸的R2均大于0．95，說明溫度點的選擇是合適的。

3．2 測定方法的選擇 熱加速穩(wěn)定性試驗所選擇的測定方法需要有足夠的靈敏度、精密度和重復性。此外，還需保證每個溫度下的測定次數(shù)(至少3次)，因此測定時需選擇適當?shù)臅r間間隔，可先在熱加速初期密集測定，再根據(jù)下降趨勢調(diào)整測定頻率。本試驗選擇ELISA檢測方法，并且由同一操作者在同一實驗室用同一儀器盡量按照相同條件完成測量，保證了較佳的測定條件，并且試驗成本較低。在每個溫度下測定次數(shù)的選擇上，本試驗采取了先密后疏的策略，在熱加速初期每周測定1次，后來逐漸加大了測定之間的時間間隔，這樣既能檢測到效價的細微下降，又能檢測到大的下降趨勢，也保證了總的測定次數(shù)。結(jié)果顯示，擬合線性回歸的相關(guān)系數(shù)較好，說明測定方法的選擇和測定時間間隔的安排也是合理的。

3．3 持續(xù)穩(wěn)定性監(jiān)測 由于生物制品本身的復雜性，加之溫度點的選擇、每個溫度點的測定次數(shù)和每次測定的樣品數(shù)量有限，用熱加速穩(wěn)定性試驗預測制品的貯存有效期也必然存在一定局限性，仍不能完全替代持續(xù)穩(wěn)定性研究，預測值和實際值之間的偏差也有很大的不確定性。因此，用熱加速穩(wěn)定性試驗預測標準物質(zhì)的貯存有效期，可以用于可能影響標準物質(zhì)穩(wěn)定性的工藝和環(huán)節(jié)的篩選和研究，也可以方便估算標準物質(zhì)在多個溫度下的有效期供參考，在標準物質(zhì)實際提供使用后，仍需定期或不定期進行持續(xù)穩(wěn)定性監(jiān)測，以確實保證標準物質(zhì)的有效性。

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