綠色熒光蛋白和胰島素基因共表達(dá)重組腺病毒載體的構(gòu)建及感染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

惠 玲，劉 毅，宋 枚

間充質(zhì)干細(xì)胞是一群具有多向分化潛能的多能干細(xì)胞，這些細(xì)胞能分化為脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、骨和軟骨細(xì)胞等中胚層來(lái)源的細(xì)胞［1］。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone mesenchymal stem cells，hBMSCs)由于取材時(shí)需行骨髓穿刺，給患者帶來(lái)痛苦，限制了其在臨床的應(yīng)用。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)可在體外分離、擴(kuò)增、培養(yǎng)，被腺病毒高效感染，經(jīng)誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞，是新的組織工程脂肪種子細(xì)胞。有報(bào)道表明，胰島素(insulin，INS)是前脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟脂肪細(xì)胞的關(guān)鍵誘導(dǎo)因子之一［2-4］，但胰島素是否在多能干細(xì)胞的脂肪分化過(guò)程中發(fā)揮作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建含人胰島素基因的腺病毒載體，并將其感染進(jìn)入hUCMSCs，利用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因?qū)崿F(xiàn)目的基因在體內(nèi)外表達(dá)的示蹤定位，研究胰島素誘導(dǎo)干細(xì)胞脂肪分化的作用及機(jī)制，為今后組織工程脂肪的構(gòu)建與體內(nèi)回植研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 含胰島素基因的原始質(zhì)粒、pShuttle-GFP-CMV穿梭質(zhì)粒、pAdxsi重組腺病毒骨架載體、DH5α菌株(北京諾賽基因組研究中心有限公司);限制性內(nèi)切酶(New England Biolabs公司，英國(guó));T4 DNA連接酶(深圳晶美生物工程有限公司);小牛腸堿性磷酸酶單酯酶(calf intestinal alkaline phosphatase，CIP)、瓊脂糖(Promega公司，美國(guó));Trizol、真核轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，美國(guó));dNTPs(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司);DNA純化試劑盒(柱離心型)、DNA凝膠回收與純化試劑盒(柱離心型)、質(zhì)粒小/中量提取純化試劑盒(北京威格拉斯生物技術(shù)有限公司);DNA Marker DL2000(大連寶生物工程有限公司);人胚腎細(xì)胞系HEK293細(xì)胞(HyClone公司，美國(guó));CsCl2、DMEM培養(yǎng)基、LG-DMEM培養(yǎng)基、FBS、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)(Sigma公司，美國(guó));RT-PCR試劑(QiaGen公司，荷蘭)。

1.2 材料 蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院婦產(chǎn)科助產(chǎn)師于無(wú)菌條件下留取足月產(chǎn)兒富含膠質(zhì)的臍帶20 cm，立即儲(chǔ)存于0．9%氯化鈉注射液中并及時(shí)處理。產(chǎn)婦均知情同意并得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 pShuttle-EGFP-INS重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將pShuttle-EGFP-CMV穿梭質(zhì)粒用EcoRI/XhoI酶切，CIP去磷酸化處理，切膠回收5．1 kb載體片段。含目的基因胰島素的原始質(zhì)粒用EcoRI/XhoI雙酶切，切膠回收約0．6 kb目的基因片段，將制備的穿梭質(zhì)粒片段和胰島素片段用T4 DNA連接酶連接。取3 μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌，涂布到卡那抗性固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單克隆菌落接種、擴(kuò)增，提取質(zhì)粒。提取的重組穿梭質(zhì)粒用EcoRI/XhoI酶切，電泳鑒定。

1.4 pAdxsi-EGFP-INS重組腺病毒載體的構(gòu)建 將pAdxsi載體用I-CeuI和I-SceI雙酶切后用CIP做去磷酸化處理，乙醇沉淀法回收;pShuttle-EGFP-INS質(zhì)粒用I-CeuI和I-SceI雙酶切后膠回收EGFP-INS片段;將上述處理好的pAdxsi和EGFP-INS片段用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌，挑選單克隆菌落，提取質(zhì)粒，用XhoI酶切電泳鑒定，鑒定正確后大量擴(kuò)增重組腺病毒載體。

1.5 重組腺病毒載體的包裝、擴(kuò)增及病毒滴度測(cè)定人胚腎細(xì)胞系HEK293細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6孔板中，次日，待細(xì)胞生長(zhǎng)至底面積的80%～90%時(shí)，將鑒定正確的pAdxsi-EGFP-INS用PacI限制性內(nèi)切酶線性化，用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體按其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。當(dāng)細(xì)胞大部分病變后，收集2個(gè)孔內(nèi)的所有細(xì)胞及培養(yǎng)液于15 ml離心管中，在干冰、乙醇及37℃水浴反復(fù)凍融3次后，3000 r/min離心5 min，收集含病毒的上清液(pAdxsi-EGFP-INS第1代毒種P1)，棄沉淀。取2 ml P1代毒種繼續(xù)感染人胚腎細(xì)胞系HEK293細(xì)胞，病毒擴(kuò)增2 d后將脫落的細(xì)胞連同培養(yǎng)液收入15 ml離心管中，2000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀中加入1 ml ST buffer(含10%血清和2．5%甘油的 DMEM培養(yǎng)液)，渦旋混勻。按上述方法，凍融3次，－80℃保存待用。按此方法反復(fù)進(jìn)行病毒擴(kuò)增及收集。測(cè)定OD260，按照公式:VP/ml=OD260 ×1．1 ×1012，計(jì)算每毫升制品中病毒顆粒數(shù)，TCID50測(cè)定病毒滴度［5］。

1.6 pAdxsi-EGFP-INS感染hUCMSCs的初步研究

1.6.1 最適MOI值的篩選研究:原代培養(yǎng)并鑒定的hUCMSCs［6］傳至第3代時(shí)接種于96孔板中，每孔5000個(gè)細(xì)胞，設(shè)置5個(gè)濃度梯度，分別加入病毒上清 0、1、5、10、20 μl，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1 h后更換為完全培養(yǎng)基。分別于24、72 h通過(guò)熒光表達(dá)確定病毒的感染效率。

1.6.2 pAdxsi-EGFP-INS感染hUCMSCs及鑒定:實(shí)驗(yàn)分兩組，將hUCMSCs以2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至85%融合時(shí)，按照最佳MOI值(100)分別加入含 pAdxsi-EGFP-INS(感染組)和pAdxsi-EGFP(對(duì)照組)的無(wú)血清 LG-DMEM 1 ml，37℃孵育6 h，期間每15分鐘震蕩細(xì)胞1次，6 h后加入1 ml含10%FBS的LG-DMEM，24 h后更換為含10%FBS的LG-DMEM。每天用熒光顯微鏡觀察熒光蛋白的表達(dá)。

1.6.3 qRT-PCR檢測(cè)胰島素基因表達(dá):感染組及對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，應(yīng)用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，常規(guī)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計(jì)INS引物:上游5'-AACACCTGTGCGGCTCTGAC-3'，下 游 5'-TTCCACAATGCCACGCTTCT-3'，內(nèi)參基因GAPDH:上游5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下 游 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。PCR 反 應(yīng) 條 件:95℃、2 min，95℃、10 s，60℃、30 s，70℃、45 s，30 個(gè)循環(huán)。采用ΔΔCt的方法進(jìn)行相對(duì)定量。

1.7 誘導(dǎo)hUCMSCs向脂肪細(xì)胞分化 將感染組和對(duì)照組hUCMSCs細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的密度接種于12孔板，培養(yǎng)3 d后加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液，成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液為含10%FBS、地塞米松10－6mol/L、IBMX 0．5 mmol/L、吲哚美辛 60 μm/L、胰島素5 mg/L的LG-DMEM培養(yǎng)基，每3或4天換液1次，第18天采用油紅O染色，于倒置顯微鏡下觀察脂肪滴的形成情況。

2 結(jié)果

2.1 pAdxsi-EGFP-INS重組腺病毒載體的構(gòu)建、鑒定及包裝 構(gòu)建的pShuttle-EGFP-INS重組穿梭質(zhì)粒，經(jīng) EcoRI/XhoI雙酶切電泳鑒定，在 0．6和5．1 kb可見(jiàn)2條帶(圖 1A)，其中 0．6 kb 條帶為含有目的基因胰島素的片段，與預(yù)期結(jié)果相同。將構(gòu)建的pAdxsi-EGFP-INS重組腺病毒載體與pAdxsi空載體分別用XhoⅠ酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳觀察顯示，pAdxsi由以下 6 個(gè)條帶組成:14．0、11．8、4．0、2．47、1．45、0．60 kb(圖1B)，而 pAdxsi-EGFP-INS 由以下 7 個(gè)條帶組成:14．00、11．80、3．10、2．66、2．47、1．45、0．60 kb(圖 1C)，結(jié)果與預(yù)期序列分析相同。將pAdxsi-EGFP-INS用人胚腎細(xì)胞系HEK293細(xì)胞進(jìn)行包裝，獲得的病毒進(jìn)行擴(kuò)增，用經(jīng)典TCID50方法進(jìn)行滴度測(cè)定，獲得的病毒滴度達(dá)到4×1011pfu/ml。

2.2 pAdxsi-EGFP-INS感染hUCMSCs最佳MOI值的確定及綠熒光蛋白表達(dá)情況 pAdxsi-EGFP-INS病毒感染hUCMSCs的最適MOI值約為100，感染效率＞95%。當(dāng)MOI值＞100時(shí)，感染效率無(wú)明顯升高(圖2)。用最佳MOI值感染hUCMSCs后4 h，感染組及對(duì)照組細(xì)胞均可觀察到綠熒光蛋白表達(dá)，48～72 h后表達(dá)趨于穩(wěn)定。兩組細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差別，綠熒光蛋白在胞漿及胞核均有表達(dá)。qRTPCR檢測(cè)結(jié)果顯示感染組INS mRNA的表達(dá)量是對(duì)照組的431．29倍，表明感染的EGFP-INS在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

圖1 pAdxsi-EGFP-INS重組腺病毒載體的構(gòu)建、鑒定

2.3 pAdxsi-EGFP-INS感染對(duì)hUCMSCs脂肪分化的影響 感染后1 d，2組均可觀察到大量的表達(dá)綠熒光蛋白的hUCMSCs(圖3A、B)，培養(yǎng)3 d后加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液，誘導(dǎo)3 d時(shí)2組細(xì)胞多為鋪展的不規(guī)則樣，相比誘導(dǎo)前細(xì)胞體積略有增大，熒光蛋白在胞漿及胞核均有分布(圖3C、D);誘導(dǎo)18 d，油紅O染色顯示2組細(xì)胞中有大量脂滴，對(duì)照組細(xì)胞中的脂滴相對(duì)集中，稍大，含有脂滴的脂肪樣細(xì)胞較少(圖3E)，而感染組細(xì)胞中的脂滴小而分散，含有脂滴的脂肪樣細(xì)胞明顯多于對(duì)照組(圖3F)。

圖2 pAdxsi-EGFP-INS感染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞不同MOI值的感染率（×100）

3 討論

hUCMSCs是多能干細(xì)胞，由于其易分離，傳代穩(wěn)定，在體外可快速擴(kuò)增，傳代后3～5 d能增殖4～5倍，傳代培養(yǎng)10代以上細(xì)胞可增殖510倍，且增殖速度無(wú)明顯降低，具有“橫向分化”或“跨系分化”的能力，可以在地塞米松、抗壞血酸、胰島素等不同誘導(dǎo)條件下，在體外分化為多種組織細(xì)胞(如神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及心肌細(xì)胞等)而成為干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)及組織工程新的種子細(xì)胞之一［7-8］。

因?yàn)橄俨《究蓪⒆陨淼幕蚪M遞送到細(xì)胞核中，并且高效率地復(fù)制，所以腺病毒成為表達(dá)和傳遞治療基因的主要候選者。腺病毒載體轉(zhuǎn)基因效率在體外實(shí)驗(yàn)研究中接近100%，可轉(zhuǎn)導(dǎo)不同類型的人組織細(xì)胞，不受靶細(xì)胞是否為分裂細(xì)胞所限，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并不整合到宿主細(xì)胞基因組，僅瞬間表達(dá)，安全性高。因而，腺病毒載體在基因治療臨床試驗(yàn)方面有了越來(lái)越多的應(yīng)用，成為繼反轉(zhuǎn)錄病毒載體之后廣泛應(yīng)用且最具前景的病毒載體［9］。本實(shí)驗(yàn)選用的pAdxsi-EGFP腺病毒系統(tǒng)是以Ad5血清型E1/E3缺陷型腺病毒DNA為骨架的復(fù)制缺陷型重組腺病毒系統(tǒng)，克隆陽(yáng)性率高、滴度高，當(dāng)MOI值為100時(shí)，攜帶綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒體外感染hUCMSCs的效率可達(dá)到90%以上，能成功地將目的基因胰島素遞送到目標(biāo)細(xì)胞。

胰島素是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的激素，除了可以調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、脂代謝及肝糖原合成外，在細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、脂肪細(xì)胞脂滴積累、脂肪溶解調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用［10-12］。Klemm 等［13］研究發(fā)現(xiàn)胰島素及其下游信號(hào)分子胰島素受體底物-1(IRS-1)、PI3K-Akt和CREB參與胰島素誘導(dǎo)的脂肪形成。胰島素通過(guò)與細(xì)胞膜上的胰島素受體結(jié)合誘導(dǎo)受體β亞單位的磷酸化并激活酪氨酸蛋白激酶，被激活的β亞單位進(jìn)而使IRS-1酪氨酸殘基磷酸化，活化的IRS-1可與各種連接物蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)代謝，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖［14］。6種胰島素類似物對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞有不同程度的誘導(dǎo)分化，可以促進(jìn)細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化［15］，說(shuō)明胰島素在脂肪細(xì)胞的成熟分化中有重要作用。同時(shí)也有研究報(bào)道，來(lái)源于骨髓基質(zhì)細(xì)胞的前脂肪細(xì)胞株P(guān)A6向成熟脂肪細(xì)胞的分化不需要胰島素的誘導(dǎo)，但胰島素受體IR及IPS-1的mRNA在PA6細(xì)胞成脂分化中表達(dá)，胰島素可以誘導(dǎo)PA6細(xì)胞中脂肪分化相關(guān)蛋白Erks、Akt、p70的磷酸化，并促進(jìn)2-脫氧－葡萄糖的吸收，提示脂肪形成過(guò)程中胰島素信號(hào)通路在骨髓來(lái)源的PA6細(xì)胞與髓外來(lái)源的脂肪細(xì)胞如(3T3-L1)不同［16］。

目前利用體外培養(yǎng)的細(xì)胞來(lái)研究脂肪細(xì)胞的分化機(jī)制主要集中于細(xì)胞的終末分化階段，但對(duì)于脂肪細(xì)胞決定前的分化調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚。作為干細(xì)胞成脂分化中的一種重要的成脂誘導(dǎo)劑，胰島素在多能干細(xì)胞成脂分化中的作用尚不清楚。本研究構(gòu)建了胰島素腺病毒表達(dá)載體并感染培養(yǎng)的hUCMSCs，并進(jìn)行了初步的體外誘導(dǎo)成脂實(shí)驗(yàn)，觀察到感染組hUCMSCs在成脂誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下分化為脂肪樣細(xì)胞，細(xì)胞中出現(xiàn)了大量的小脂滴，含有小脂滴的細(xì)胞數(shù)量多，而對(duì)照組hUCMSCs中的脂肪樣細(xì)胞數(shù)量少，細(xì)胞中的脂滴較大但量少，提示胰島素感染對(duì)干細(xì)胞的成脂分化有影響，但具體機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們還將攜帶有胰島素的hUCMSCs與可降解的生物支架材料(如PLGA等)聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行組織工程脂肪構(gòu)建，研究移植細(xì)胞分泌的胰島素對(duì)移植細(xì)胞的成脂是否有促進(jìn)作用。

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