穿刺巴斯德芽菌熒光定量PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

賀 樂， 黃惠琴， 朱 軍， 劉 敏， 孫前光， 鮑時翔

（1.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，?？?570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，?？?571101）

根結(jié)線蟲（Meloidogynespp.）是經(jīng)濟(jì)作物的重要病原線蟲之一［1］。全世界主要農(nóng)作物因根結(jié)線蟲造成的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)500多億美元［2］，其中北方根結(jié)線蟲（M.haplaChitwood）、南方根結(jié)線蟲［M.incognita（Kofoid et White）］、爪哇根結(jié)線蟲［M.javanica（Treub）］和花生根結(jié)線蟲［M.arenaria（Neal）］4種最常見的根結(jié)線蟲病害占全部損失的90%以上［3］。在全球變暖的大趨勢下，根結(jié)線蟲病害將更為嚴(yán)重。

穿刺巴斯德芽菌［PasteuriapenetransThome（Sayre ＆Starr）］為革蘭氏陽性菌［4］，專性寄生于根結(jié)線蟲［5］，能夠顯著抑制線蟲病害，提高作物產(chǎn)量［6］。相對于廣泛使用的防治根結(jié)線蟲的化學(xué)藥品，它對環(huán)境無污染，是一種理想的生防菌劑材料［5］。然而，穿刺巴斯德芽菌尚未實現(xiàn)純培養(yǎng)，且該菌在生長過程中形態(tài)多變，難以定性、定量觀察。同時，該菌與根結(jié)線蟲的寄生關(guān)系存在一定特異性，特定菌株只能高效寄生于某一種或幾種線蟲。尋找到廣譜寄生的菌株資源，是穿刺巴斯德芽菌商業(yè)化應(yīng)用的前提之一［7］。因此，建立一種特異性較高的穿刺巴斯德芽菌定性、定量檢測方法，對該菌培養(yǎng)方法的優(yōu)化和菌株資源的尋找都有著重要意義。

本文驗證了穿刺巴斯德芽菌16S r DNA中一段序列的特異性，優(yōu)化了熒光定量PCR反應(yīng)體系，并以質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建了定量曲線，建立了能定性、定量檢測該菌的熒光定量PCR方法。同時確定了該體系用于檢測含穿刺巴斯德芽菌土壤樣品時的可檢測菌體濃度閾值。

1 材料與方法

1.1 菌株與土樣

枯草芽胞桿菌由本實驗室保存；穿刺巴斯德芽菌芽胞分離自感染根結(jié)線蟲的胡椒根；根結(jié)線蟲病土采自五指山潘陽鎮(zhèn)和萬寧萬城鎮(zhèn)的胡椒根結(jié)線蟲病地；不含穿刺巴斯德芽菌的土壤樣品為采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯嶒灥匾约扒鍨懜奂t樹林土壤的等比例混合物。

試驗中用到的主要試劑和儀器有：SYBR?Premix Ex TaqTM（Ta KaRa公司）、PCR Taq Mix（康為世紀(jì)公司）、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖校∣mega公司）、載體p MD 19－T vector（Ta KaRa公司）、DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（全式金公司）、DNA凝膠回收試劑盒（Biomega公司）、土壤DNA提取試劑盒（MP公司）、PCR儀（Biometra公司）、MX3005P熒光定量PCR儀（Stratagene公司）、Fastprep 24TM核酸提取儀（MP公司）。

1.2 穿刺巴斯德芽菌芽胞總DNA提取

收集含穿刺巴斯德芽菌芽胞的雌蟲，壓破，制成懸浮液，2 000×g低速離心1 min，取上清，去除線蟲蟲體等雜質(zhì)。

取芽胞液500μL，加入盛有無菌玻璃珠的離心管中，添加等體積酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）溶液；將離心管置于FastprepTM核酸提取儀中，6.5 m／s，破碎180 s；14 000×g離心10 min，取上清，加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1），搖勻再次離心；取上清，加入兩倍體積的無水乙醇，輕搖混勻，－20℃沉淀過夜；4℃，14 000 g離心10 min，輕倒乙醇，加入500μL的70%乙醇清洗2～3次，自然風(fēng)干，加入20μL無菌水溶解，－20℃保存待用。

1.3 枯草芽胞桿菌總DNA提取

挑取適量枯草芽胞桿菌菌體溶解于500μL水溶液，參照1.2方法提取總DNA。

1.4 土壤總DNA提取

按照MP公司土壤DNA提取試劑盒提取土壤樣品總DNA［8］，DNA溶液 －20℃保存。

1.5 熒光定量PCR特異性評價

以穿刺巴斯德芽菌16S r DNA目的片段為靶點，設(shè)穿刺巴斯德芽菌芽胞總DNA為陽性對照，以不含穿刺巴斯德芽菌的土壤總DNA以及枯草芽胞桿菌總DNA為陰性對照，進(jìn)行熒光定量PCR檢測，評價靶點特異性。

熒光定量PCR體系正向引物（617F）：CGTGTAAGCGTTCGAAACGGT，反向引物 （1166R）：CGCCGGCTGTCTCTCCAA［9］。 循 環(huán) 參 數(shù)：94 ℃預(yù)變性30 s，接著40個循環(huán)，每個循環(huán)的程序包括94℃變性7 s、55℃退火15 s、72℃延伸15 s，在55℃末采集熒光。循環(huán)結(jié)束后，從55℃逐步上升至95℃，全過程收集熒光數(shù)據(jù)，用于構(gòu)建熔解曲線。試劑參考SYBR?Premix Ex TaqTM說明書添加。

1.6 PCR體系優(yōu)化

用Oligo軟件計算出引物的Tm值，在Tm值上、下波動5℃的范圍內(nèi)篩選反應(yīng)最適退火溫度。每個溫度重復(fù)兩次，取平均值，利用Mx3005P儀器附帶軟件比較各退火溫度的差異。選取正、反向引物100、300、600、900 nmol／L 等4個不同濃度分別組合，進(jìn)行qPCR反應(yīng)引物濃度的優(yōu)化。

1.7 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以穿刺巴斯德芽菌芽胞總DNA為模板，擴(kuò)增靶序列。使用DNA凝膠回收試劑盒純化擴(kuò)增產(chǎn)物。將目的片段連接至p MD 19－T vector，轉(zhuǎn)入大腸桿菌培養(yǎng)，挑取陽性克隆，進(jìn)行測序驗證。

按照質(zhì)粒提取試劑盒的操作說明提取質(zhì)粒；使用純水作參照，測定重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品吸光度，計算重組標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的拷貝濃度。

1.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

利用最佳反應(yīng)條件對10倍梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（2.48～2.48×106拷貝／PCR）進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，確定靶點檢測靈敏度。以起始模板濃度對數(shù)為x軸，Ct值為y軸，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線；重復(fù)4次試驗，求取Ct值平均數(shù)和變異系數(shù)，確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性和可重復(fù)性。

1.9 土壤樣品的熒光定量PCR測定

分別將含有1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102個穿刺巴斯德芽菌芽胞的300μL芽胞液加入0.5 g無穿刺巴斯德芽菌土壤樣品中，提取該6份土壤樣品以及采自潘陽鎮(zhèn)、萬城鎮(zhèn)的根結(jié)線蟲胡椒病地土樣總DNA，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，測定土壤中穿刺巴斯德芽菌芽胞最低的可檢測濃度以及2份病土中該菌菌體濃度。

2 結(jié)果

2.1 靶點特異性評價

特異性試驗結(jié)果顯示，該靶點只對穿刺巴斯德芽菌總DNA能產(chǎn)生擴(kuò)增信號，無穿刺巴斯德芽菌土壤總DNA、枯草芽胞桿菌總DNA均無擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段大小約為550 bp，與目的片段大小相符。因而，該靶點對穿刺巴斯德芽菌具有良好的特異性。

2.2 熒光定量PCR體系優(yōu)化

退火溫度優(yōu)化試驗的擴(kuò)增曲線（圖1）顯示，在57～60℃之間時Ct值與平臺期熒光值變化較小，61℃時熒光值顯著減小，為保證反應(yīng)效率以及特異性，選取最佳退火溫度為60℃。

圖1 引物退火溫度優(yōu)化Fig.1 Optimization of the annealing temperature for the primers

引物濃度優(yōu)化結(jié)果（圖2）顯示，正、反向引物濃度分別為900、300 nmol／L時Ct值最小，故選定此濃度組合為最佳的引物濃度。

圖2 引物濃度優(yōu)化Fig.2 Optimization of the concentration for the primers

2.3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)曲線

提取經(jīng)多次純化的陽性克隆菌落的質(zhì)粒，利用特異靶點的引物對質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小約550 bp的片段，與目的片段相符；BLAST分析質(zhì)粒DNA序列顯示，插入片段與目的片段的同源性為100%，表明質(zhì)粒構(gòu)建成功。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品DNA溶液A260／A280值為1.8，DNA純度較高。經(jīng)計算，溶液拷貝濃度為2.48×1013拷貝／PCR。

熒光定量PCR反應(yīng)時，在設(shè)置的質(zhì)粒樣品濃度梯度樣品中，當(dāng)拷貝濃度為24.8拷貝／PCR時產(chǎn)生特異擴(kuò)增，而在濃度為2.48拷貝／PCR時，則無擴(kuò)增信號。表明該靶點對質(zhì)粒樣品拷貝數(shù)的可檢測閾值為24.8拷貝／PCR。

以6個濃度梯度質(zhì)粒樣品（24.8～2.48×106拷貝／PCR）的Ct值和質(zhì)粒拷貝濃度對數(shù)為坐標(biāo)軸構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y＝－3.200×logx＋34.43，相關(guān)系數(shù)R2為0.998，擴(kuò)增效率為105.4%（圖3）。重復(fù)測定4次，6個濃度梯度質(zhì)粒樣品的Ct值的平均值依次為30.64±0.12、28.18±0.08、24.42±0.12、21.29±0.15、17.66±0.07、15.25±0.09，對應(yīng)變異系數(shù)分別為0.41%、0.30%、0.49%、0.72%、0.40%、0.58%，均小于5%；標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠，重復(fù)性良好，可用于穿刺巴斯德芽菌的定量檢測。

2.4 土壤樣品的熒光定量PCR檢測

針對人工添加穿刺巴斯德芽菌芽胞的土壤樣品，檢測結(jié)果（圖4）顯示Ct值隨土壤中芽胞濃度的增加而減小；當(dāng)芽胞濃度在2×103個／g土壤或者以上時，PCR反應(yīng)產(chǎn)生特異性擴(kuò)增；而芽胞濃度為2×102個／g土壤時，無擴(kuò)增信號。因而，以所選靶點為基礎(chǔ)的熒光定量PCR檢測方法，對土壤中穿刺巴斯德芽菌芽胞的最低可檢測芽胞濃度為2×103個／g土壤。

對胡椒根結(jié)線蟲病地土壤樣品進(jìn)行熒光定量PCR檢測，潘陽鎮(zhèn)土樣有特異性擴(kuò)增信號，且Ct值與芽胞數(shù)量2×103個／g土壤樣品接近；萬城鎮(zhèn)土樣無擴(kuò)增信號。這表明潘陽土樣中含有穿刺巴斯德芽菌，芽胞含量約為2×103個／g土壤，而萬城鎮(zhèn)土樣中沒有穿刺巴斯德芽菌或者其濃度小于可檢測閾值。

3 討論

熒光定量PCR是一種快速、特異性高的檢測方法，在微生物的定性、定量檢測上運用廣泛。目前，尚無該方法檢測穿刺巴斯德芽菌培養(yǎng)樣品及土壤樣品的報道。本文以穿刺巴斯德芽菌16S r DNA中的片段為靶點，經(jīng)過特異性驗證和反應(yīng)條件優(yōu)化，構(gòu)建了該菌的熒光定量PCR檢測方法；此方法對含穿刺巴斯德芽菌芽胞土壤樣品的可檢測芽胞濃度閾值為2×103個／g土壤，靈敏度與PasteurianishizawaeSayre et al.土壤樣品的可檢測閾值處于同一水平［10］。挑取兩處病地胡椒根結(jié)中成熟雌蟲進(jìn)行顯微觀察時，發(fā)現(xiàn)從潘陽鎮(zhèn)采集的胡椒根中有大量穿刺巴斯德芽菌，在萬城鎮(zhèn)病地中則未發(fā)現(xiàn)。

在該菌的培養(yǎng)方面，經(jīng)過長期探索，本課題組已脫離植物成功實現(xiàn)人工擴(kuò)培，但尚未實現(xiàn)純培養(yǎng)，且該菌在生長過程中形態(tài)多變，通過顯微觀察等方法難以對其進(jìn)行定性、定量檢測。以特異性、靈敏度見長的熒光定量PCR檢測方法，是該菌定量檢測的最佳選擇之一。熒光定量PCR中，用于定量的標(biāo)準(zhǔn)品一般有菌體總DNA、質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物3種。由于穿刺巴斯德芽菌尚未被純培養(yǎng)，且野外菌株資源難以獲取，若以總DNA為標(biāo)準(zhǔn)品對該菌進(jìn)行定量，有一定的局限性。PCR產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品則有保存周期短、拷貝數(shù)難以確定等缺點。本文以保存更長久且拷貝濃度確定的重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線。本方法對質(zhì)粒樣品的檢測限為24.8拷貝／PCR，該值與任月等［11］所構(gòu)建的糞便中腸球菌熒光定量PCR檢測方法的檢測限在同一水平。此定量檢測方法對穿刺巴斯德芽菌的特異性較高，檢測濃度范圍廣、靈敏度高，可用于該菌的定量檢測。

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