甘草查爾酮B體外細(xì)胞毒作用研究

冉芳，楊帆，楊新惠，王振華，張波，鄭秋生

（石河子大學(xué)藥學(xué)院／新疆特種植物藥資源教育部重點實驗室，石河子，832002）

甘草查爾酮B（Licochalcone B，LCB）是一類查爾酮類化合物。查爾酮類化合物分子能與不同的生物受體結(jié)合，對腫瘤細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用，其作用機(jī)制包括：抑制微管蛋白聚合、抗血管生成、誘導(dǎo)凋亡、抗雌激素以及逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性［1］。研究表明，查爾酮是具有應(yīng)用前景的新型抗腫瘤先導(dǎo)化合物。本研究旨在觀察甘草查爾酮B對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用，初步探討其作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究甘草查爾酮B的抗腫瘤作用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 細(xì)胞株與藥物

MCF－7、T24、HeLa、B16F10、B16F0購買于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，本實驗室保種。甘草查爾酮B購自上海麗臣公司，純度大于98%，用DMSO配制成2×104μg／mL母液備用，用前用完全培養(yǎng)基稀釋成所需濃度，各給藥組DMSO濃度不大于0．5%。

1．2 主要試劑

RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）購自Gibco公司；胎牛血清購于杭州四季青公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、臺盼藍(lán)（Typan blue）購自北京拜爾迪生物技術(shù)公司；JC－1染料購自Sigma公司。

1．3 方法

1．3．1 細(xì)胞增殖實驗

細(xì)胞增殖實驗使用MTT法，于96孔板中進(jìn)行。取對數(shù)生長期細(xì)胞按5000個／孔接種于96孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后，設(shè)不同濃度梯度，加藥100μL，每組設(shè)6個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔加入 MTT工作液（5．0mg／mL）20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO，微量振蕩器振蕩10min使結(jié)晶物充分溶解，酶標(biāo)儀在570nm檢測波長，630nm參考波長下檢測每孔的吸光度（A）值。

計算藥物對細(xì)胞增殖的抑制率（IR）＝（1－A給藥孔／A對照孔）×100%，再根據(jù)藥物濃度對應(yīng)細(xì)胞增殖抑制率作線性回歸，根據(jù)直線方程計算藥物對細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1．3．2 臺盼藍(lán)拒染法測定致死率［2］

取細(xì)胞對數(shù)生長期的B16F0細(xì)胞，計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度為1×105／mL，按3mL孔加入6孔板中，加甘草查爾酮B，其終濃度分別為5．0、7．5、10．0、12．5μg／mL，培養(yǎng)24h。取90μL細(xì)胞懸液加于200μL離心管中，再加入10μL0．4%臺盼藍(lán)染液，用細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)死細(xì)胞個數(shù)，計算甘草查爾酮B對B16F0細(xì)胞的致死率。

1．3．3 相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)

取細(xì)胞對數(shù)生長期的B16F0細(xì)胞，計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度為1×105／mL，按3mL／孔加入6孔板中，加甘草查爾酮B，其終濃度分別為7．5和12．5μg／mL，培養(yǎng)24h，于倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞數(shù)。

1．3．4 線粒體膜電勢測定

取甘草查爾酮B處理2h的B16F0細(xì)胞，臺盼蘭染色法進(jìn)行計數(shù)，取1×106個／mL細(xì)胞，離心（1500g×5min），棄上清液，加2mL PBS緩沖液潤洗一次，加100μL的10μmol／L JC－1熒光染料重懸細(xì)胞、混勻，然后將細(xì)胞置于37℃水浴中20 min，用PBS潤洗2次，洗去未結(jié)合的熒光染料，酶標(biāo)儀進(jìn)行線粒體膜電勢檢測紅色／綠色熒光強(qiáng)度比值衡量線粒體去極化程度。

1．3．5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2．1 甘草查爾酮B對5種細(xì)胞的生長抑制作用

實驗結(jié)果見表1。

由表1可知：甘草查爾酮B以不同濃度分別作用于 MCF－7、T24、HeLa、B16F10、B16F0 5種腫瘤細(xì)胞24h后，細(xì)胞生長均受到不同程度的抑制，并呈量效關(guān)系，其IC50分別為12．1、11．12、12．38、12．14、10．73μg／mL。

為了進(jìn)一步研究甘草查爾酮B對腫瘤細(xì)胞增殖機(jī)制，我們在下面試驗中選取B16F0細(xì)胞作進(jìn)一步探討。

表1 甘草查爾酮B對5種細(xì)胞的生長抑制作用X±S，n＝3Tab．1Growth inhibition of LCB in five kinds cell

2．2 甘草查爾酮B對B16F0細(xì)胞致死率

不同濃度甘草查爾酮B（5～15μg／mL）處理24 h后，采用臺盼藍(lán)拒染法對B16F0細(xì)胞的致死率進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖1。

圖1 甘草查爾酮B對B16F0細(xì)胞致死率的影響Fig．1Effects of LCB on the fatality rate in B16F0cells

由圖1可知：甘草查爾酮B以不同濃度作用于B16F0細(xì)胞24h后，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞的死亡率也增加。

2．3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

相差顯微鏡下觀察細(xì)胞，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知：正常B16F0貼壁生長，分布均勻，細(xì)胞接觸緊密。甘草查爾酮B作用于細(xì)胞24h后，細(xì)胞間隙增大，脫壁細(xì)胞增多漂浮在培養(yǎng)基中，并且隨著藥物濃度的增加，上述變化愈加明顯。

2．4 甘草查爾酮B對B16F0細(xì)胞△ψm的影響

結(jié)果見表2。

圖2 相差顯微鏡觀察B16F0細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化Fig．2The effect of LCB on morphological changes of B16F0cell under phase contrast microscope

由表2可知：JC－1是一種陽離子熒光染料，由于線粒體內(nèi)膜的電負(fù)性而聚集在活細(xì)胞線粒體內(nèi)形成多聚體，呈鮮紅色熒光；但在凋亡細(xì)胞內(nèi)，由于△Ψm的破壞，不能聚集到線粒體內(nèi)，以單體的形式存在于胞質(zhì)發(fā)綠色熒光；紅色／綠色熒光強(qiáng)度比例下降，通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變來檢測線粒體膜電位的變化。B16F0細(xì)胞經(jīng)5、7．5、10、12．5、15μg／mL的甘草查爾酮B作用24h后，線粒體膜電勢降低，且呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系。

表2 甘草查爾酮B對B16F0細(xì)胞△ψm的影響X±S，n＝3Tab．2Effects of LCB on△ψm in B16F0cells

3 討論

甘草查爾酮B是一類查爾酮類化合物。甘草查爾酮B具有顯著的抗菌作用，對革蘭氏陽性菌具有較強(qiáng)的抑制活性［3］。甘草中的5種查爾酮類成分均具有抗氧化作用，其中以甘草查爾酮B和C的作用最為顯著，認(rèn)為查爾酮的B環(huán)結(jié)構(gòu)與抗氧化活性密切相關(guān)［4－6］。甘草查爾酮A和B能夠增加花生四烯酸的形成，抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集作用［7］。本研究通過MTT和臺盼藍(lán)檢測發(fā)現(xiàn)，甘草查爾酮B對B16F0細(xì)胞的惡性增殖具有抑制作用，并且誘導(dǎo)線粒體膜電勢降低，且呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)甘草查爾酮B對5種細(xì)胞增殖活性均有抑制作用，并且細(xì)胞生長均受到不同程度的抑制，且呈量效關(guān)系。選取B16F0細(xì)胞進(jìn)行臺盼藍(lán)拒染實驗，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞的致死率略微有所增加，與對照組相比，藥物處理組并無顯著差異。腫瘤細(xì)胞的增殖受到抑制的可能機(jī)制主要有4種：1）是引起細(xì)胞的死亡（包括凋亡）；2）是引起細(xì)胞周期各時相的等比例延長；3）是細(xì)胞被阻滯在周期中的某一個時相；4）是細(xì)胞發(fā)生再分化，失去了腫瘤細(xì)胞的惡性特征［8］。

研究表明，在不同因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中，在細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變之前均出現(xiàn)線粒體膜電位的下降?？梢?，線粒體膜電位下降是凋亡的早期表現(xiàn)，一旦線粒體膜電位損耗，細(xì)胞就會進(jìn)入不可逆的凋亡過程。抑制線粒體膜電位下降，就可能阻抑細(xì)胞凋亡的發(fā)生，說明線粒體膜電位下降為凋亡的特征性改變［9］。經(jīng)對誘導(dǎo)凋亡后的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析檢測也表明，線粒體膜電位的下降要早于DNA斷裂和胞膜磷脂酰絲氨酸外翻，也早于凋亡時細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變、蛋白酶Caspase－3激活等變化，提示線粒體膜電位下降是凋亡早期階段［10］。本實驗應(yīng)用JC－1染色，發(fā)現(xiàn)甘草查爾酮B各濃度作用于B16F0細(xì)胞24 h后，線粒體膜電勢降低，且呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系。由此推測，甘草查爾酮B對B16F0細(xì)胞的增殖抑制作用可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用有關(guān)。

綜上所述，甘草查爾酮B能夠抑制B16F0細(xì)胞的惡性增殖。實驗結(jié)果檢測到甘草查爾酮B以不同濃度作用于B16F0細(xì)胞，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞的致死率略微有所增加；相差顯微鏡下觀察細(xì)胞，細(xì)胞增殖變慢，細(xì)胞間隙增大，脫壁細(xì)胞增多漂浮在培養(yǎng)基中，并且隨著藥物濃度的增加，上述變化愈加明顯；線粒體膜電勢降低，且呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系。從而推測，甘草查爾酮B對B16F0細(xì)胞的增殖抑制作用可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用有關(guān)。雖然甘草查爾酮B對B16F0細(xì)胞的增殖抑制作用機(jī)制還不清楚，但是本研究結(jié)果表明，更深入地探討其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制是十分有價值的，甘草查爾酮B有可能成為治療惡性腫瘤的候選化合物。

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