人β防御素-3在人工關(guān)節(jié)感染患者中的表達(dá)及其意義的實(shí)驗(yàn)研究

倪衛(wèi)東，羅 羲，費(fèi) 軍，黃顯凱，杜順華

人工關(guān)節(jié)術(shù)后感染被稱為人工關(guān)節(jié)置換術(shù)的災(zāi)難性并發(fā)癥，其中由血漿凝固酶陰性的葡萄球菌等毒力較低的細(xì)菌所致的慢性感染，常難以明確診斷并與無菌性松動鑒別［1］，目前尚無統(tǒng)一診斷標(biāo)準(zhǔn)。筆者采用觀察人β防御素-3(human beta-defensin-3，HBD-3)在人工關(guān)節(jié)感染、假體無菌性松動、占位器治療后的假體周圍的松質(zhì)骨及正常髂骨中的表達(dá)情況，初步探討其與人工關(guān)節(jié)感染的關(guān)系，為進(jìn)一步探索其能否作為人工關(guān)節(jié)感染診斷及與假體無菌性松動鑒別的一種方法奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1 一般資料

自2009年11月～2010年4月及2012年7月～2012年9月，收集住院治療患者術(shù)中切取的人工關(guān)節(jié)感染患者假體周圍組織13例(男性8例，女性5例);假體無菌性松動的假體周圍組織8例(男性5例，女性3例);明確診斷為人工關(guān)節(jié)感染經(jīng)清創(chuàng)，放置萬古霉素骨水泥占位器和抗生素等綜合治療，感染得到有效控制后行關(guān)節(jié)翻修術(shù)者的占位器周圍組織9例(男性4例，女性5例);四肢骨折患者行取髂骨植骨的正常髂骨7例(男性3例，女性4例)。按臨床診斷分別分為人工關(guān)節(jié)感染組、假體無菌性松動組、占位器治療后組及正常組。收集所有患者的術(shù)前外周血白細(xì)胞計數(shù)、ESR、CRP結(jié)果。

人工關(guān)節(jié)感染組均為術(shù)后2個月及以上始出現(xiàn)患肢關(guān)節(jié)持續(xù)性疼痛患者。其納入標(biāo)準(zhǔn)采用骨肌系統(tǒng)感染學(xué)會(musculoskeletal infection society，MSIS)2012年發(fā)布的假體周圍感染的診斷方法，如下:(1)存在與假體相通的竇道;(2)假體周圍組織兩處或多處取材或關(guān)節(jié)滑液細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果為同一病原菌;(3)以下6種情況滿足4種及以上者:① a.血沉及血清C-反應(yīng)蛋白增高者;② 關(guān)節(jié)滑液白細(xì)胞計數(shù)增高者;③ 關(guān)節(jié)滑液中性粒細(xì)胞百分比增高者;④ 關(guān)節(jié)內(nèi)發(fā)現(xiàn)膿液者;⑤ 假體周圍組織或關(guān)節(jié)滑液一次細(xì)菌培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌者;⑥ 假體周圍組織高倍鏡(400倍)下＞5個中性粒細(xì)胞，至少5個獨(dú)立視野。本組13例中3例為金黃色葡萄球菌，5例為血漿凝固酶陰性的葡萄球菌，1例表皮葡萄球菌，1例銅綠假單胞菌，3例未培養(yǎng)出細(xì)菌。

2 切片制備和HE染色光鏡觀察

所有標(biāo)本以4%多聚甲醛固定，固定后置入0.5M PH8.0的EDTA緩沖液中脫鈣，每7天更換1次相同濃度EDTA緩沖液，直至細(xì)針插入組織無阻力時為脫鈣終點(diǎn)。常規(guī)脫水透明及石蠟包埋，連續(xù)5μm切片。常規(guī)HE染色，光鏡下觀察各組組織切片的形態(tài)及炎性細(xì)胞浸潤情況。

3 切片免疫熒光染色和觀察

3.1 主要試劑:抗HBD-3為鼠抗人多克隆抗體(NOVUS公司)。兔抗小鼠熒光抗體(ZYMED公司)。

3.2 染色、觀察和平均光密度值測量:切片經(jīng)脫蠟復(fù)水，枸櫞酸鹽抗原熱修復(fù)，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，1%BSA封閉以減少非特異性染色，4℃孵育一抗過夜。復(fù)溫后孵育TRITC染料標(biāo)記的熒光二抗及DAPI染色，封片鏡檢，以PBS代替一抗作陰性對照。倒置相差熒光顯微鏡下觀察陽性細(xì)胞數(shù)目及強(qiáng)度，任選5個獨(dú)立視野成像，并采用Imagepro plus(IPP)7.0C圖像分析軟件，測量每個視野下陽性細(xì)胞的平均光密度值。

3.3 統(tǒng)計方法:采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)不滿足t檢驗(yàn)的要求(正態(tài)且方差齊)，故采用兩獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組HE染色結(jié)果

各組大體組織肉眼觀察無區(qū)別，各組HE染色結(jié)果于顯微鏡下(×200)觀察，見各組切片組織主要為骨小梁及骨髓構(gòu)成，形態(tài)無明顯差別，各組均無炎性細(xì)胞浸潤(圖1)。

圖1 各組骨組織HE染色情況( ×200)

2 各組免疫熒光染色結(jié)果

免疫熒光染色于OLYMPUS-IX71倒置相差熒光顯微鏡下觀察HBD-3表達(dá)情況。如圖2所示，人工關(guān)節(jié)感染組、假體無菌性松動組及占位器治療后組均可見骨細(xì)胞的胞漿中存在HBD-3表達(dá)(綠色箭頭所示)，且無明顯差異。人工關(guān)節(jié)感染組、假體無菌性松動組、占位器治療后組及正常組的骨小梁的骨內(nèi)膜上均可見不同程度的HBD-3(白色箭頭所示)，以感染組最多及陽性程度最高，依次為假體無菌性松動組、占位器治療后組、正常組。藍(lán)色顆粒則為被DAPI所染色的細(xì)胞核(黃色箭頭所示)。

圖2 各組松質(zhì)骨免疫熒光染色情況( ×200)

3 各組平均光密度值結(jié)果

表1 各組的平均光密度值±s)

表1 各組的平均光密度值±s)

images/BZ_221_233_1474_1192_1532.png 人工關(guān)節(jié)感染組13 0.473±0.017無菌性松動組 8 0.345±0.006a占位器治療后組 9 0.242±0.005bd正常組 7 0.138±0.003cde

人工關(guān)節(jié)感染組與假體無菌性松動組比較:aP＜0.01;人工關(guān)節(jié)感染組與占位器治療后組比較:bP＜0.01;人工關(guān)節(jié)感染組與正常組比較:cP＜0.01;無菌性松動與占位器治療后組比較:dP＜0.01;無菌性松動組與正常組比較:dP＜0.01;占位器治療后組與正常組比較:eP＜0.01

4 外周血白細(xì)胞計數(shù)、ESR、CRP結(jié)果

其中外周血白細(xì)胞計數(shù)正常參考范圍為(4～10×109);ESR正常參考范圍為(男 ＜15mm/h，女＜20mm/h)CRP正常參考范圍為(0～0.8)。各項指標(biāo)結(jié)果以各組結(jié)果以±s)的形式表示，結(jié)果如下見表2。

表2 各組白細(xì)胞計數(shù)、ESR、CRP結(jié)果(±s)

表2 各組白細(xì)胞計數(shù)、ESR、CRP結(jié)果(±s)

分組 白細(xì)胞計數(shù)(×109) ESR(mm/h)CRP(mg/dl)人工關(guān)節(jié)感染組0.39±0.08 6.19±1.98 35.15±23.47 2.39±2.51無菌性松動組 6.26±0.88 8.13±2.64a0.41±0.08占位器治療后組 5.24±0.81 10.78±5.31b0.50±0.24正常組 6.12±0.68 8.29±2.29c

外周血白細(xì)胞計數(shù)各組兩兩比較:P＞0.05。ESR及CRP人工關(guān)節(jié)感染組與假體無菌性松動組比較:aP＜0.01;人工關(guān)節(jié)感染組與占位器治療后組比較:bP＜0.01;人工關(guān)節(jié)感染組與正常組比較:cP＜0.01;無菌性松動與占位器治療后組比較，無菌性松動組與正常組比較及占位器治療后組與正常組比較:P＞0.05

討 論

人工關(guān)節(jié)感染為內(nèi)置物相關(guān)感染，按病程區(qū)分可分為急性感染、亞急性感染和慢性感染。其中急性感染臨床表現(xiàn)較為明顯，診斷多無困難。然而慢性感染則多為如血漿凝固酶陰性的葡萄球菌等毒力較低的致病菌所致的人工關(guān)節(jié)假體周圍感染，時常難以與假體無菌性松動進(jìn)行有效鑒別，目前尚缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。其診斷方法為結(jié)合患者病史、癥狀及體征、影像學(xué)檢查及各種輔助檢查結(jié)果依靠術(shù)者經(jīng)驗(yàn)作出綜合判斷。然而慢性人工關(guān)節(jié)感染患者常無特異性臨床表現(xiàn)及體征，各種檢查方法各有其局限性，術(shù)者的經(jīng)驗(yàn)并不完全相同，因此現(xiàn)臨床應(yīng)用的診斷方法并不完全可靠。

外周血白細(xì)胞計數(shù)是臨床常用的感染診斷指標(biāo)，在局部感染和其他非感染性疾病時均可出現(xiàn)不同程度的增高，對慢性人工關(guān)節(jié)感染的診斷價值有限［2］。Di Cesare 等［3］報告患者術(shù)前外周血白細(xì)胞計數(shù)在人工關(guān)節(jié)感染與非感染間的差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義，本研究中各組兩兩比較均無統(tǒng)計學(xué)意義，因此我們認(rèn)為外周血白細(xì)胞計數(shù)在慢性人工關(guān)節(jié)感染的診斷及其與假體無菌性松動的鑒別中價值不大。但同時仍應(yīng)認(rèn)識到，當(dāng)外周血白細(xì)胞計數(shù)升高超出正常參考范圍時，依然可以提示存在感染可能，盡管影響其升高的因素較多。

ESR及CRP是診斷感染性疾病的常用指標(biāo)，但在用于單純診斷人工關(guān)節(jié)感染時，尚需排除患者同時存在其他部位感染、合并結(jié)締組織疾病或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等可導(dǎo)致ESR及CRP升高的情況。Della Valle等［2］的研究報道ESR對人工關(guān)節(jié)感染診斷的準(zhǔn)確率為77%，CRP的準(zhǔn)確率為84%。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為在排除干擾因素后，ESR及CRP在診斷人工關(guān)節(jié)感染時仍具有較高的診斷效力［2-3］。本研究中ESR和CRP在感染組與假體無菌性松動組間的差別及感染組與正常組間的差別具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明ESR和CRP在人工關(guān)節(jié)感染的診斷及其與假體無菌性松動的鑒別中均具有參考價值。盡管如此，但其值正常時仍不能除外人工關(guān)節(jié)感染。

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是一類具有廣譜抗菌性的活性小分子肽類，是多種生物機(jī)體的一線防御物質(zhì)［4-5］，具有高效、廣譜及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)。人防御素為抗菌肽中的一個家族，其中人 β防御素現(xiàn)主要發(fā)現(xiàn)有 3種［6］，HBD-3比HBD-1、HBD-2具有更強(qiáng)的抗菌活性［7］，人β防御素(HBD-3除外)的抗菌活性在生理鹽濃度下或二價陽離子存在時可受到強(qiáng)烈抑制［8-9］，且HBD-3的表達(dá)增高與感染、腫瘤等疾病的發(fā)生具有相關(guān)性［10-11］。而 Warnke等［12］的研究表明，HBD-3 是骨組織固有免疫的一部分，在感染下顎骨中，骨小梁旁的骨內(nèi)膜上及骨細(xì)胞的胞漿中均存在表達(dá)。而正常下顎骨的骨內(nèi)膜上表達(dá)相對前者較弱，且骨細(xì)胞胞漿中無HBD-3表達(dá)，Stockmann等［13］對顎骨壞死的研究報告了相同的結(jié)果。但HBD-3在人工關(guān)節(jié)感染和假體無菌性松動的松質(zhì)骨中的表達(dá)是否具有差異，以及其差異能否幫助判斷感染或感染與松動的區(qū)分，目前國內(nèi)外尚無相關(guān)研究。

人工關(guān)節(jié)感染的治療單獨(dú)使用抗生素是很難成功治愈的，且藥物必須滿足對細(xì)菌敏感，能抑制細(xì)菌生物膜的形成以及能殺滅生物膜內(nèi)的細(xì)菌［14］，因此常需手術(shù)治療。人工關(guān)節(jié)感染的治療多采用Ⅱ期翻修，即取出原有假體，盡可能清除炎性組織后配合使用抗生素及放置萬古霉素骨水泥占位器等綜合治療，待感染得到有效控制后再進(jìn)行翻修術(shù)的手術(shù)方式，優(yōu)點(diǎn)在于感染清除率高，再感染率較低［15］。人工關(guān)節(jié)感染、占位器治療后、感染治愈，是人工關(guān)節(jié)感染Ⅱ期翻修治療的3個階段，現(xiàn)尚無HBD-3在占位器治療后的骨組織中的相關(guān)報道。

本研究分為4組，分別為人工關(guān)節(jié)感染組、假體無菌性松動組、占位器治療后組、正常組。慢性人工關(guān)節(jié)感染通常為深部感染，存在感染或炎癥反應(yīng)的范圍較廣。在放置萬古霉素占位器等綜合治療后，即便感染的癥狀得到有效控制，ESR和CRP指標(biāo)正常時，深部組織內(nèi)仍存在炎癥反應(yīng)。假體無菌性松動所產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)，與磨損的聚乙烯顆粒等異物刺激有關(guān)［16-17］，其炎癥反應(yīng)為慢性無菌性炎癥反應(yīng)。在各組平均光密度值的結(jié)果中，感染組高于其余各組，無菌性松動組高于正常組，占位器治療后組高于正常組。推測感染或炎癥反應(yīng)可誘導(dǎo)HBD-3在局部的表達(dá)增加，且與其程度具有一定相關(guān)性，在感染局部的表達(dá)可能是一種能較好反應(yīng)局部炎癥程度的指標(biāo)。就取材部位而言，本研究所取組織為感染局部組織，反應(yīng)的是感染局部的炎癥反應(yīng)的情況，僅需要除外可引起局部炎癥反應(yīng)的一些疾病和情況。而臨床常用的外周血白細(xì)胞計數(shù)、ESR、CRP為取外周靜脈血所得出的結(jié)果，反應(yīng)的是機(jī)體對感染等疾病作出的全身性反應(yīng)的情況，可受到諸如患者其他部位存在感染或結(jié)締組織病等多種方面的影響，尚需排除可引起其增高的全身性和(或)局部性疾病等因素，所需除外的因素較多而復(fù)雜。

綜上分析我們認(rèn)為，在人工關(guān)節(jié)感染的假體周圍的松質(zhì)骨內(nèi)，HBD-3的表達(dá)都可能能較好的反應(yīng)局部感染的情況，對于人工關(guān)節(jié)感染的診斷及其與假體無菌性松動的鑒別是一種較好的參考指標(biāo)或方法。對Ⅱ期翻修綜合治療后，感染是否已控制的判斷上也具有一定參考價值。

［1］ Zimmerli W，Ochsner PE.Management of infection associated with prosthetic joints［J］.Infection，2003，31(2):99-108.

［2］ Della Valle CJ，Sporer SM，Jacobs JJ，et al.Preoperative testing for sepsis before revision total knee arthroplasty［J］.J Arthroplasty，2007，22(6S2):90-93.

［3］ Di Cesare PE，Chang E，Preston CF，et al.Serum interleukin-6 as a marker of periprosthetic infection following total hip and knee arthroplasty［J］.J Bone Joint Surg(Am)，2005，87(9):1921-1927.

［4］Beisswenger C，Bals R.Functions of antimicrobial peptides in host defense and immunity［J］.Curr Protein Pept Sci，2005，6(3):255-264.

［5］ Dubin A，Mak P，Dubin G，et al.New generation of peptide antibiotics［J］.Acta Biochim Pol，2005，502(3):633-638.

［6］ Selsted ME，Tang YQ，Morris WL，el al.Purification，primary structures，and antibacterial activities of beta-defensins，a new family of antimicrobial peptides from bovine neutrophils［J］.J Biol Chem，1993，268(9):6641-6648.

［7］ Paulsen F，Pufe T，Conradi L，et al.Antimicrobial peptides are expressed and produced in healthy and inflamed human synovial membranes［J］.J Pathol，2002，198(3):369-377.

［8］ Harder J，Bartels J，Christophers E，et al.Isolation and characterization of human beta-defensin-3.a novel human inducible peptide an tibiotic［J］.J Biol Chem，2001，276(8):5707-5713.

［9］ Garcia JR，Jaumann F，Sehulz S，et al.Identification of a novel，multifunctional beta-defensin(human beta-defensin3)with specific antimicrobial activity:its interaction with plasma membranes of Xenopus oeytes and the induction of maerophage chemoattraction［J］.Cell Tissue Res，2001，306(2):257-264.

［10］ Dressel S，Harder J，Cordes J，et al.Differential expression of antimicrobial peptides in margins of chronic wounds［J］.Exp Dermatol，2010，19(7):628-632.

［11］ Shuyi Y，F(xiàn)eng W，Jing T.Human beta-defensin-3(hBD-3)upregulated by LPS via epidermal growth factor receptor(EGFR)signaling pathways to enhance lymphatic invasion of oral squamous cell carcinoma［J］.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2011，112(5):616-625.

［12］ Warnke PH，Springer IN，Russo PA，et al.Innate immunity in human bone［J］.Bone，2006，38(3):400-408.

［13］ Stockmann P，Wehrhan F，Schwarz-Furlan S，et al.Increased human defensine levels hint at an inflammatory etiology of bisphosphonate-associated osteonecrosis of the jaw:an immunohistological study［J］.J Transl Med，2011，15(9):135-141.

［14］ Zimmerli W，Trampuz A，Ochsner PE.Prosthetic-Joint infections［J］.N Engl J Med，2004，351(16):1645-1654.

［15］ Haddad FS，Muirhead-Allwood SK，Manktelow AR，et a1.Two-stage uncemented revision hip arthroplasty for infection［J］.J Bone Joint Surg(Br)，2000，82(5):689-694.

［16］Harris WH.Wear and periproshetic osteolysis:the problem［J］.Clin Orthop Relat Res，2001，12(393):66-70.

［17］ Matthews JB，Besong AA，Green TR，et al.Evaluation of the response of pirmary human peirpheral blood mononuclear phagocytes to challenge with in vitro generated clinically relevant UHMWPE patricles of known size and dose［J］.J Biomed Mater Res，2000，52(2):296-307.