HPLC-ELSD測定咽速康氣霧劑中每撳膽酸含量

常新全，楊娜，宋瀟

(1.中國藥材公司，北京 102600；2.華頤藥業(yè)有限公司，北京 102600)

HPLC-ELSD測定咽速康氣霧劑中每撳膽酸含量

常新全1*，楊娜2，宋瀟2

(1.中國藥材公司，北京 102600；2.華頤藥業(yè)有限公司，北京 102600)

目的：建立咽速康氣霧劑中每撳君藥人工牛黃中膽酸的含量測定方法。方法：采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法，流動(dòng)相：以甲醇為流動(dòng)相A，以0.1%冰醋酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫，流速：1.0 mL·min-1，柱溫：35 ℃，漂移管溫度：35 ℃，載氣：高純氮?dú)?，氣體壓力：33 psi，進(jìn)樣量：15 μL。結(jié)果：膽酸在0.254 1～1.270 5 μg呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(r=0.999 9)，平均回收率為100.27%，RSD=2.13%(n=6)。結(jié)論：方法專屬性強(qiáng)，精密度良好，準(zhǔn)確度高，線性良好，耐用性適宜，使用期和瓶間均一性好，可以測定咽速康氣霧劑每撳膽酸的含量。

咽速康氣霧劑；膽酸；含量測定

咽速康氣霧劑是由人工牛黃、珍珠、雄黃、蟾酥、人工麝香、冰片等中藥制成的氣霧劑，方劑組成來源于“六神丸”，具有解毒、消腫、止痛功能，臨床用于咽喉腫痛、單雙乳蛾的肺胃實(shí)熱證，療效確切。人工牛黃為方中君藥，膽酸為人工牛黃主要有效成分?；瘜W(xué)藥品中絕大部分定量閥門氣霧劑檢查每撳主藥含量[1]，《中國藥典》一部自2000年版起規(guī)定中藥定量閥門氣霧劑需檢查每撳主藥含量[2-3]，經(jīng)查閱公開文獻(xiàn)，至今無中藥氣霧劑檢查每撳主藥含量的研究報(bào)道[4-5]。另外，氣霧劑不同于口服、注射等給藥途徑的制劑，測定氣霧劑瓶內(nèi)每毫升藥液主藥含量，并不代表實(shí)際服用量，因此，為了精確控制定量閥門氣霧劑主藥的服用量，參照文獻(xiàn)[6]方法，研究建立咽速康氣霧劑使用過程中每撳膽酸含量測定的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters公司高效液相色譜儀：包括Waters600泵，Waters717plus自動(dòng)進(jìn)樣器，Waters 2424ELSD檢測器，Empower2色譜工作站。

1.2 試藥

甲醇(色譜純)，高純水，其他試劑均為分析純。膽酸(購自中國食品藥品檢定研究院，批號：110731-200513)。咽速康氣霧劑(華頤藥業(yè)有限公司，批號：1105001，1105002，1105003)。人工牛黃陰性樣品系按處方比例，除去人工牛黃，其余中藥按咽速康氣霧劑制備工藝制得。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Kromasil(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇為流動(dòng)相A，以0.1%冰醋酸溶液為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫，流速：1.0 mL·min-1，柱溫：35℃。蒸發(fā)光散射檢測器檢測參數(shù)：漂移管溫度為35 ℃，載氣為高純氮?dú)猓瑲怏w壓力為33 psi；進(jìn)樣量為15 μL。理論板數(shù)以膽酸峰計(jì)算應(yīng)不低于2 500。

表1 膽酸流動(dòng)相洗脫條件

2.2 對照品溶液制備

取膽酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含膽酸0.05 mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備

取50 mL燒杯，加入15 mL無水乙醇。取本品，試噴5下，洗凈噴口，充分干燥。將噴口置燒杯底部(液面下約2 cm)，噴10次，每次噴射時(shí)間間隔5秒，每噴射前充分振搖，取出藥瓶，用無水乙醇洗凈噴頭，合并無水乙醇液，水浴濃縮至約1 mL，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加入甲醇2 mL，超聲處理(功率150 W，頻率25 kHz)15 min，取出，放至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 專屬性試驗(yàn)

取人工牛黃陰性樣品適量，精密稱定，按2.3制備方法制成陰性對照溶液，按照上述色譜條件，注入液相色譜儀，與膽酸對照品色譜圖、咽速康氣霧劑樣品色譜圖對比，結(jié)果見圖1～3。

圖1 膽酸對照品色譜圖(Rt：14.255 min)

圖2 人工牛黃陰性樣品色譜圖

圖3 咽速康氣霧劑樣品色譜圖(Rt：14.218 min)

結(jié)果表明，陰性樣品色譜圖在膽酸保留時(shí)間處無色譜峰，在試驗(yàn)條件下，其他中藥對測定無干擾。

2.5 線性關(guān)系考察試驗(yàn)

分別精密吸取膽酸對照品溶液(0.050 82 mg·mL-1)5,10,15,20,25 μL，注入液相色譜儀中，以進(jìn)樣量(取對數(shù))為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(取對數(shù))為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸處理，得回歸方程：Y=0.930 4X+3.872 6，r=0.999 9，結(jié)果表明膽酸在0.254 1～1.270 5μg呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn)

2.6.1 儀器精密度 按2.3制備方法，制備供試品溶液1份，按照色譜條件，進(jìn)樣6次，結(jié)果平均峰面積為944.5，RSD=3.99%，表明儀器精密度良好。

2.6.2 重復(fù)性試驗(yàn) 按2.3制備方法，分別按正常取樣噴次(10次)的50%(5次)、100%(10次)、150%(15次)的噴次數(shù)取樣，各平行處理3份，共9份供試品溶液，取供試品溶液15 μL，注入液相色譜儀，計(jì)算9份供試品每撳膽酸的平均含量為24.9 μg，RSD=3.88%，說明該方法的高、中、低濃度的重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取50 mL燒杯，加入15 mL無水乙醇，取咽速康氣霧劑，試噴5下，洗凈噴口，充分干燥，將噴口置燒杯底部(液面下約2 cm)，噴5次，每噴射前充分振搖，水浴濃縮至約1 mL，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，精密加入膽酸的對照品溶液(0.050 82 mg·mL-1)2.0 mL，加甲醇至刻度，搖勻，即得。平行操作6份，測定，計(jì)算回收率。結(jié)果表明，本試驗(yàn)方法的回收率在95.20%～109.25%，平均回收率為105.01%，RSD=5.13%，說明本方法的準(zhǔn)確度較高。

2.8 檢測限及定量限

在選定的色譜條件下，參照文獻(xiàn)[7]，以信噪比3∶1時(shí)注入液相色譜儀對應(yīng)的膽酸的量為本方法的檢測限，信噪比10∶1時(shí)注入液相色譜儀對應(yīng)的膽酸的量為本方法的定量限。結(jié)果表明，膽酸的檢測限和定量限分別為0.064 μg，0.13 μg。

2.9 劑量均一性試驗(yàn)

2.9.1 使用期劑量均一性 取3瓶樣品(批號為1105002)，參照文獻(xiàn)[8]，按照以上測定方法，每個(gè)樣品分別在使用期的初期(6～15噴次)，中期(36～45噴次)，后期(66～75噴次)各測定1次，結(jié)果表明樣品使用期內(nèi)劑量均一性良好，見表2。

表2 使用期劑量均一性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.9.2 瓶間劑量均一性 取10瓶樣品(批號為1105002)，按照供試品溶液制備方法，每瓶樣品制備1份供試品溶液，注入液相色譜儀，進(jìn)行測定，結(jié)果表明咽速康氣霧劑瓶間膽酸均一性很好，見表3。

表3 瓶間劑量均一性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.10 耐用性試驗(yàn)

2.10.1 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 按2.3方法制得供試品溶液，于制備后第0，4，8，12，24，48 h測定膽酸含量，結(jié)果表明供試品溶液的膽酸含量在48 h之內(nèi)變化不大，RSD=1.7%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)相對比較穩(wěn)定。

2.10.2 提取時(shí)間的影響試驗(yàn) 取3份本品藥液，每份10 mL，置25 mL容量瓶中，分別加入甲醇10 mL，超聲處理(功率150 W，頻率25 kHz)15，30，45 min，取出，放至室溫，加甲醇定容至刻度，濾過，取續(xù)濾液測定，比較不同超聲時(shí)間膽酸的含量。結(jié)果提取時(shí)間變化后膽酸含量的RSD=1.1%，表明提取時(shí)間在15～45 min變化對膽酸的提取基本沒有影響。考慮到方法的簡捷性，選擇超聲處理15 min作為提取時(shí)間。

2.10.3 柱溫的影響試驗(yàn) 按2.3方法制備供試品溶液，柱溫分別設(shè)定為25，35，40 ℃，其他色譜條件不變，測定，計(jì)算各個(gè)柱溫時(shí)的供試品中膽酸的含量。試驗(yàn)結(jié)果表明，柱溫在25～40℃變化時(shí)，膽酸含量的RSD=0.53%，對膽酸含量測定結(jié)果影響很小。

2.10.4 色譜柱的影響試驗(yàn) 取3份本品藥液，每份10 mL，按2.3方法制備供試品溶液，分別選用3個(gè)品牌的C18色譜柱試驗(yàn)，其他色譜條件不變，測定，計(jì)算不同色譜柱時(shí)的供試品中膽酸的含量。試驗(yàn)結(jié)果表明，更換不同品牌的C18色譜柱，膽酸含量的RSD=0.58%，對膽酸含量測定影響很小。

從上述的溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)，提取時(shí)間、柱溫、色譜柱的變化試驗(yàn)，說明本方法耐用性良好。

2.11 樣品含量測定

采用上述方法對3批咽速康氣霧劑(批號：1105001，105002，1105003)進(jìn)行含量測定，結(jié)果每撳膽酸含量分別為19.14，21.35，19.32 μg。

3 討論

3.1 供試品溶液制備時(shí)取樣撳次選擇

咽速康氣霧劑每毫升含膽酸最低限為0.5 mg，正常情況下每瓶含膽酸1.5 mg，按平均撳次95次計(jì)算，每撳含膽酸理論值為15.3 μg，經(jīng)以每撳噴出藥液制備供試品溶液，以進(jìn)樣量15 μL計(jì)，僅有0.046 μg膽酸進(jìn)樣，所得膽酸峰面積低于定量限。經(jīng)推算與試驗(yàn)，選擇10撳次噴出藥液制備供試品溶液較為合適。

3.2 膽酸每撳含量指標(biāo)確定

通過對咽速康氣霧劑每撳人工牛黃中膽酸含量測定方法的驗(yàn)證，說明本實(shí)驗(yàn)方法專屬性強(qiáng)、精密度良好、準(zhǔn)確度高、線性良好、耐用性適宜和劑量均一性良好，故應(yīng)將其列入咽速康氣霧劑藥品標(biāo)準(zhǔn)。

結(jié)合3批咽速康氣霧劑每撳含量測定實(shí)際值，考慮到該產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的復(fù)雜性，確定每撳中人工牛黃含膽酸不得少于11 μg。

作者經(jīng)過研究探索，建立了HPLC-ELSD測定咽速康氣霧劑中每撳膽酸含量的方法，并經(jīng)方法學(xué)考察，能夠精確控制使用環(huán)節(jié)咽速康氣霧劑的實(shí)際服用量，填補(bǔ)了中藥氣霧劑每撳主藥含量檢查的空白，是中藥氣霧劑質(zhì)量控制水平的進(jìn)步。另外，咽速康氣霧劑還含有大毒中藥蟾酥和雄黃，為了保障其安全性，我們也建立了這兩味中藥的每撳毒性成分含量測定方法及上下限控制范圍，將另文發(fā)表。

[1] 岳志華,張啟明,牛秀華.對幾種氣霧劑的質(zhì)量考察和新版藥典氣霧劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂的建議[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2007，8(6)：445-447.

[2] 國家藥典委員會(huì).中國藥典[S].一部.附錄ⅠZ.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2000：附錄19.

[3] 國家藥典委員會(huì).中國藥典[S].一部.附錄ⅠZ.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄16.

[4] 張慧燕.關(guān)于完善中藥氣霧劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建議[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2005，6(1):55-56.

[5] 劉華鋼.中藥氣霧劑的研究概況[J].廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2003，6(1)：58-62.

[6] 季艷艷，周林，常新全，等.HPLC-ELSD測定咽速康氣霧劑中膽酸的含量[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010,16(10):91-92,95.

[7] 曹進(jìn),徐燕,王義明,等.清開靈注射液中三種膽酸含量測定方法比較[J].中成藥，2003，25(9)：705-708.

[8] 金方，侯曙光，魏農(nóng)農(nóng).氟利昂替代后吸入氣霧劑(MDIs)的研究要求和進(jìn)展I—?dú)W美拋射劑替代的MDIs研發(fā)和質(zhì)量控制[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2009，40(7)：543-548.

HPLC-ELSDDeterminationofBileAcidperActuationinYansukangAerosol

CHANG Xin-quan1*，YANG Na2，SONG Xiao2

(1.ChinaNationalCorp.ofTraditional&HerbalMedicine，Beijing102600，China; 2.HuayiPharmaceuticalCo.，Ltd，Beijing102600，China)

Objective： To develop a high performance liquid chromatography(HPLC)method for the quantification of bile acid,a main active ingredient of artificial bezoar in Yansukang aerosol,for the purpose of assaying the drug content per actuation.Methods： HPLC-evaporative light scattering method was used.Mobile phase:methanol was mobile phase A,0.1% glacial acetic acid solution was mobile phase B,gradient elution.Flow velocity:1.0mL·min-1.Column temperature:35 ℃.Temperature of drift tube:35 ℃.Carrier gas:high purity nitrogen.Gas pressure:33 psi.Sample size:15 μL.Results: Bile acid linear rage was 0.254 1～1.270 5 μg,r=0.999 9.The average recovery rate was 100.27%,RSD=2.13%(n=6).Conclusion: The method was specific,and had good precision,high accuracy,good linearity,appropriate durability,and good homogeneity.The assay was demonstrated to be suitable to measure bile acid content per actuation in Yansukang aerosol.

Yansukang aerosol; Bile acid; Content determination

2013-02-22)

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常新全，高級工程師，Tel:(010)61252991,E-mail:13911273610@139.com