正交試驗(yàn)法優(yōu)選防己配方顆粒的提取工藝△

陳娟，梁小銀，林大都，嚴(yán)萍，林文華，詹若挺，陳蔚文

(廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源科學(xué)與工程研究中心 嶺南中藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006)

中藥工業(yè)

正交試驗(yàn)法優(yōu)選防己配方顆粒的提取工藝△

陳娟，梁小銀，林大都，嚴(yán)萍*，林文華，詹若挺，陳蔚文

(廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源科學(xué)與工程研究中心 嶺南中藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006)

目的：優(yōu)選防己配方顆粒的提取工藝。方法：采用正交試驗(yàn)法，以出膏率、粉防己堿和防己諾林堿的提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察加水量、提取次數(shù)和提取時(shí)間3個(gè)因素，優(yōu)選出防己配方顆粒的提取工藝。結(jié)果：確定防己配方顆粒的最優(yōu)提取工藝為防己飲片第1 次加8倍量水，浸泡0.5 h，煎煮1.5 h，第2次加6倍量水，煎煮1.5 h。結(jié)論：該工藝條件提取充分，穩(wěn)定可行，可為防己配方顆粒的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化生產(chǎn)提供一定參考依據(jù)。

防己；配方顆粒；提取工藝；正交試驗(yàn)；粉防己堿；防己諾林堿

防己為防己科植物粉防己StephaniatetrandraS.Moore的干燥根，具有祛風(fēng)止痛，利水消腫的功效，用于風(fēng)濕痹痛，水腫腳氣，小便不利，濕疹瘡毒[1]。此外臨床上還用于治療高血壓病和心絞痛[2-3]。防己主要含粉防己堿、防己諾林堿、輪環(huán)藤酚堿、氧防己堿、防己斯任堿、小檗胺、粉防己堿D鹽酸鹽、荷包牡丹堿等生物堿類成分[2,4]。中藥配方顆粒包裝小，攜帶方便，可免去患者自行煎煮的過(guò)程，方便患者使用，同時(shí)也符合中醫(yī)藥的發(fā)展前景[5]。該研究通過(guò)采用正交試驗(yàn)法，以出膏率、粉防己堿和防己諾林堿為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選防己配方顆粒的提取工藝參數(shù)，從而為其實(shí)際生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀(四元泵自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng))，Waters 2998二極管陣列檢測(cè)器，Empower化學(xué)工作站(美國(guó)沃特世公司)；Milli-Q超純水設(shè)備(法國(guó)，Millipore公司)；BS224S電子天平(德國(guó)Sartorius公司，萬(wàn)分之一)，XR205SM-DR電子天平(瑞士Precisa公司,十萬(wàn)分之一)；DGX-9073鼓風(fēng)干燥箱(上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥

粉防己堿對(duì)照品(批號(hào)：110711-9103)、防己諾林堿(批號(hào)：110793-200003)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；防己(產(chǎn)地：安徽)，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)詹若挺研究員鑒定為防己科植物粉防己StephaniatetrandraS.Moore的干燥根。乙腈(Merk公司)為色譜純，水為超純水，甲醇等其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 出膏率的測(cè)定

取防己水提液，濾過(guò)，精密吸取濾液50 mL，置于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻1 h，迅速稱重，按公式計(jì)算出膏率。

W1—蒸發(fā)皿恒重與干膏重之和，W2—蒸發(fā)皿恒重，M—藥材質(zhì)量，V1—樣品溶液總體積，V2—量取的藥液體積。

2.2 粉防己堿、防己諾林堿的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用Inertsil ODS-3(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以乙腈-甲醇-水-冰醋酸(40∶30∶30∶1)(每100 mL含十二烷基磺酸鈉0.41 g)為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，以A-B(85∶15)等度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，柱溫為30 ℃。理論板數(shù)按粉防己堿峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備和線性關(guān)系 取粉防己堿對(duì)照品、防己諾林堿對(duì)照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 mL含粉防己堿0.1 mg、含防己諾林堿0.05 mg的對(duì)照品溶液，即得。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：粉防己堿Y=3.555×105X+2.269×104，r=0.999 2；防己諾林堿Y=4.469×105X+2.117×104，r=0.999 6；結(jié)果表明粉防己堿和防己諾林堿分別在0.531～6.372 μg，0.263～3.151 μg呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取防己水提液25 mL，置分液漏斗中，用三氯甲烷振搖提取3 次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，揮干，殘?jiān)蛹状既芙?，并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.4 測(cè)定方法 分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定(見(jiàn)圖1)，以外標(biāo)一點(diǎn)法分別計(jì)算粉防己堿和防己諾林堿的含量。

1.防己諾林堿，2.粉防己堿A.防己諾林堿 B.供試品 C.粉防己堿圖1 防己供試品及對(duì)照品HPLC圖

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

經(jīng)預(yù)試驗(yàn)，根據(jù)影響提取的主要因素，固定浸泡時(shí)間為0.5 h，選擇加水量、提取次數(shù)和提取時(shí)間作為考察因素，以出膏率、粉防己堿和防己諾林堿為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按L9(34)表進(jìn)行正交試驗(yàn)?？疾煲蛩睾退揭?jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

注：綜合評(píng)價(jià)計(jì)算方法：在正交設(shè)計(jì)的9組試驗(yàn)中，以各評(píng)價(jià)指標(biāo)的最高得率試驗(yàn)組值為100%，其余試驗(yàn)組的結(jié)果相應(yīng)折算為其最高值的百分比，再以出膏率、粉防己堿含量和防己諾林堿含量權(quán)重分別占40%、30%和30%的比例進(jìn)行相加而得。

2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

根據(jù)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)各評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響因素進(jìn)行直觀分析(見(jiàn)表2)和方差分析(見(jiàn)表3～5)，結(jié)果可見(jiàn)以出膏率、粉防己堿含量和防己諾林堿含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，加水量、提取次數(shù)和提取時(shí)間影響均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中分別篩選得到以出膏率為考察指標(biāo)的最佳工藝為A2B3C3，粉防己堿含量的最佳工藝為A2B2C3，防己諾林堿含量的最佳工藝為A2B2C1；此外，根據(jù)3個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，經(jīng)對(duì)綜合評(píng)價(jià)結(jié)果進(jìn)行直觀分析(見(jiàn)表2)和方差分析(見(jiàn)表6)，結(jié)果可見(jiàn)加水量、提取次數(shù)和提取時(shí)間對(duì)綜合評(píng)價(jià)影響均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，綜合評(píng)價(jià)的最佳工藝為A2B2C3，綜合考慮上述各指標(biāo)的篩選結(jié)果，最終選擇最優(yōu)工藝為A2B2C3，即第1次加8倍量水，浸泡0.5 h，煎煮1.5 h，第2次加6倍量水，煎煮1.5 h。

表3 出膏率方差分析

表4 粉防己堿含量方差分析

表5 防己諾林堿含量方差分析

表6 綜合評(píng)價(jià)方差分析

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取防己飲片500 g，平行3份，按最優(yōu)工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表7。結(jié)果表明正交試驗(yàn)的最優(yōu)工藝的放大驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)與最優(yōu)工藝結(jié)果差異不大。

表7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 /%

3 討論

中藥配方顆粒是一種遵循中醫(yī)學(xué)基本理論，運(yùn)用現(xiàn)代制藥工藝，將單味中藥飲片經(jīng)過(guò)加工煎煮、過(guò)濾濃縮、噴霧干燥等程序，使之成為中醫(yī)臨床上可隨機(jī)組方，即沖即飲的顆粒劑型[6]。臨床要求其要具有與原藥相同的功效[7]，因此，研究中藥配方顆粒的最優(yōu)提取條件有現(xiàn)實(shí)的必要性。粉防己堿和防己諾林堿是防己的主要活性成分，也是防己在《中國(guó)藥典》2010年版中的含量測(cè)定控制指標(biāo)成分。因此，選取出膏率、粉防幾堿含量和防幾諾林堿含量作為優(yōu)選防己配方顆粒最優(yōu)提取工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)，具有一定代表性和合理性。

參照傳統(tǒng)煎煮法，中藥飲片一般煎煮2次，為提高中藥的利用率，本研究在正交試驗(yàn)中設(shè)計(jì)了提取次數(shù)為1次、2次和3次；傳統(tǒng)煎煮的第1次加水量為輕輕按住飲片至加入的水面高出藥物2～3 cm的量，因此正交試驗(yàn)提取3次的加水量水平設(shè)計(jì)為6倍、4倍、4倍，8倍、6倍、6倍和10倍、8倍、8倍；提取時(shí)間則選擇了0.5，1.0，1.5 h。正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析表明加水量、提取次數(shù)和提取時(shí)間3個(gè)因素對(duì)出膏率、粉防幾堿含量和防幾諾林堿含量3個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)均無(wú)顯著性影響，最后綜合考慮確定了防己配方顆粒的最優(yōu)提取工藝參數(shù)為第1次加8倍量水，浸泡0.5 h，煎煮1.5 h，第2次加6倍量水，煎煮1.5 h，合并兩次濾液。最后經(jīng)放大實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果進(jìn)一步表明優(yōu)選的工藝合理、穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，可為防己配方顆粒的規(guī)范化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010：139.

[2] 南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典[M].上冊(cè).上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2006:1367.

[3] 葛長(zhǎng)艷.粉防己、廣防己的鑒別與臨床應(yīng)用[J].中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育,2011,9(1)：83.

[4] 李行諾,閆海霞,沙娜,等.粉防己生物堿化學(xué)成分的分離與鑒定[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2009,26(6)：430-433.

[5] 董紅麗.中藥配方顆粒和中藥湯劑的比較[J].現(xiàn)代診斷與治療,2012,23(7)：911-912.

[6] 陳坤全,陳益強(qiáng).中藥飲片顆粒劑和中藥湯劑的比較[J].河北醫(yī)藥,2003,25(10)：775.

[7] 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局.中藥配方顆粒管理暫行規(guī)定[S].2001.

OptimizationofExtractionTechnologyofStephaniatetradraS.MooreDispensingGranulesbyOrthogonalExperiment

CHEN Juan,LIANG Xiao-yin,LIN Da-du,YAN Ping*,LIN Wen-hua,ZHAN Ruo-ting,CHEN Wei-wen

(ResearchCenterofChineseHerbalResourceScienceandEngineering,GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine,KeyLaboratoryofChineseMedicinalResourcefromLingnan,MinistryofEducation，Guangzhou510006，China)

Objective： To optimize the extraction process ofStephaniatetradraS.Moore dispensing granules.Methods： The extraction process of the dispensing granules was optimized through orthogonal experiment while the yield of dry extracts,the content of tetrandrine and fangchinoline,and influences of solvent dosage,extraction time and extraction times were studies.Results: The optimized extraction conditions ofStephaniatetradraS.Moore dispensing granules:the material was added 8 times amount of water,soaked for 0.5 h and extracted for 1.5 h at the first time,and for the second time,6 times amount of water were added,extracted for 1.5 h.Conclusion: The optimum extraction process is stable and feasible for the standardized production technology ofStephaniatetradraS.Moore dispensing granules.

StephaniatetradraS.Moore; Dispensing granules; Extraction process; Orthogonal experiment; Tetrandrine; Fangchinoline

2013-01-23)

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中央財(cái)政支持地方高校發(fā)展專項(xiàng)——南藥可持續(xù)利用研究與綜合開(kāi)發(fā)利用(粵財(cái)教[2010]358號(hào))

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嚴(yán)萍，Tel：(020)39358331，E-mail：ycyyp22@163.com