茜草中總黃酮的超聲提取工藝研究

王建壯，施玉旋，鄭榮杰，周曄，程力惠，呂華沖*

(1.廣東藥學(xué)院 藥科學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.中山大學(xué) 孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院 藥學(xué)部，廣東 廣州 510120；3.廣東省第二人民醫(yī)院 藥學(xué)部，廣東 廣州 510317)

中藥工業(yè)

茜草中總黃酮的超聲提取工藝研究

王建壯1，施玉旋2，鄭榮杰3，周曄1，程力惠1，呂華沖1*

(1.廣東藥學(xué)院 藥科學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.中山大學(xué) 孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院 藥學(xué)部，廣東 廣州 510120；3.廣東省第二人民醫(yī)院 藥學(xué)部，廣東 廣州 510317)

目的：優(yōu)化茜草中總黃酮的超聲提取工藝。方法：以硝酸鋁顯色法測(cè)定總黃酮提取率，通過單因素試驗(yàn)探討了乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間等因素對(duì)總黃酮提取率的影響，并采用正交試驗(yàn)確定了最佳提取條件。結(jié)果：茜草總黃酮的最佳提取工藝為乙醇濃度60%，料液比1∶30，提取時(shí)間50 min，此條件下總黃酮的提取率為2.730%。結(jié)論：與傳統(tǒng)提取方法相比，該工藝提取效率高、提取時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單且結(jié)果穩(wěn)定。

茜草；超聲波提??；總黃酮；正交試驗(yàn)

茜草為茜草科植物茜草RubiacordifoliaL.的干燥根和根莖。性苦，寒。歸肝經(jīng)。具有涼血，祛瘀，止血，通經(jīng)的作用。用于吐血，衄血，崩漏，外傷出血，瘀阻經(jīng)閉，關(guān)節(jié)痹痛，跌撲腫痛[1]。目前，已經(jīng)報(bào)道的茜草總黃酮的提取方法有實(shí)驗(yàn)微型法、常規(guī)溶劑法[2]和熱浸提法[3]，這些方法都比較耗時(shí)耗能，而且提取效率不高。超聲波提取技術(shù)具有能耗低、效率高、可避免高溫對(duì)提取成分的影響等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于提取植物中的生物堿、苷類、黃酮類等生物活性物質(zhì)[4]。為了提高茜草總黃酮的提取效率，作者采用乙醇為溶劑和超聲波輔助提取技術(shù)，利用正交試驗(yàn)法對(duì)茜草總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與儀器

蘆丁對(duì)照品(成都曼特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-11040302，含量：99%)；茜草(廣州大參林藥房)；NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、乙醇及其他試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

UV-2550紫外可見分光光度計(jì)(島津香港有限公司)；KH-3200DB超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；JA1203N電子天平(上海精密科學(xué)儀器公司)；循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的配制[3]準(zhǔn)確稱取干燥至恒定質(zhì)量的蘆丁對(duì)照品11.4 mg，用80%的乙醇溶解，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶，用80%乙醇定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.114 mg·mL-1的蘆丁對(duì)照品溶液。

2.1.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 準(zhǔn)確吸取上述對(duì)照品溶液5.0 mL置25 mL量瓶中，加入1.0 mL 5% NaNO2溶液，然后加1.0 mL 10% Al(NO3)3溶液靜置6 min后，再加入10.0 mL 4%NaOH溶液，最后用80%乙醇定容至刻度，搖勻，放置10 min；以空白試劑為對(duì)照，用紫外可見分光光度計(jì)在400～700 nm下進(jìn)行掃描，對(duì)照品溶液在504 nm處有最大吸收，因此測(cè)定波長(zhǎng)選擇504 nm。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[3]準(zhǔn)確吸取上述對(duì)照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL 分別置于10 mL容量瓶中，各加80%乙醇溶液至5 mL，加5%NaNO2溶液0.5 mL，搖勻放置6 min，再加10%Al(NO3)3溶液0.5 mL，搖勻，再放置6 min，加4%NaOH溶液4 mL，搖勻放置15 min，在504 nm處測(cè)定各對(duì)照品溶液的吸光度值，以蘆丁質(zhì)量濃度(X)對(duì)吸光度值(Y)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程Y=11.158X-0.014，r=0.999 5。

2.1.4 樣品中總黃酮的提取和含量測(cè)定 將茜草干燥，粉碎過篩。取一定量的粉末置索氏提取器中，加適量石油醚60 ℃提取至無色，放冷，取出粉末，自然揮干石油醚后，備用。分別準(zhǔn)確稱取樣品粉末1.0 g置于具塞錐形瓶中，加入相應(yīng)濃度和料液比的乙醇溶液，然后置于超聲波清洗器中，按相應(yīng)的時(shí)間進(jìn)行超聲提取，提取2次。提取液離心分離，過濾除渣，用提取溶劑定容至100 mL量瓶中，得到樣品溶液，備用。準(zhǔn)確吸取樣品溶液2.0 mL，置于10 mL容量瓶，按2.1.3項(xiàng)下方法操作，測(cè)定吸光度(A)，然后按公式計(jì)算總黃酮提取率：

式中：W為茜草粉質(zhì)量(g)。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取其中一份樣品溶液，按2.1.3項(xiàng)方法顯色，在15，30，45，60，75，90 min時(shí)測(cè)定其吸光度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在90 min內(nèi)RSD=1.77%，說明樣品溶液顯色15 min后，在90 min內(nèi)較穩(wěn)定，結(jié)果較可信。

2.1.6 加樣回收率試驗(yàn) 分別準(zhǔn)確吸取2 mL的已知總黃酮含量的樣品溶液9份，分別按樣品總黃酮含量的80%，100%和120%加入蘆丁對(duì)照品，形成低、中、高3種濃度，每個(gè)濃度各分別制備3份供試品溶液，按2.1.3項(xiàng)方法顯色并測(cè)量其吸光度，計(jì)算其加樣回收率。結(jié)果表明，其平均回收率為99.86%，RSD=1.07%，符合分析要求。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響 在超聲30 min、料液比為1∶30的條件下，考察乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。 隨著乙醇濃度的增大，總黃酮的提取率也相應(yīng)增大，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60%時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最高，當(dāng)乙醇濃度高于60%時(shí)，總黃酮提取率不增加反而下降。

圖1 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

2.2.2 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響 在乙醇濃度為60%、超聲時(shí)間為30 min的條件下，考察不同料液比對(duì)總黃酮提取率的影響。結(jié)果如圖2所示。隨著料液比的比例加大，總黃酮提取率呈明顯上升趨勢(shì)，料液比1∶30之后增加不明顯。

圖2 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響 在乙醇濃度為60%，料液比為1∶30的條件下，考察不同時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響。結(jié)果如圖3所示。隨著超聲提取時(shí)間的增加，總黃酮類物質(zhì)提取率增加，當(dāng)提取時(shí)間為50 min時(shí)，黃酮提取率達(dá)到最高，隨后提取率逐漸降低。

圖3 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

2.3 正交試驗(yàn)

以總黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察不同乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間在超聲提取條件下對(duì)茜草中總黃酮提取效果的影響。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)影響總黃酮提取效果的3個(gè)主要因素設(shè)置3個(gè)水平(見表1)，用L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇最佳提取工藝條件。結(jié)果見表2。

由表2中的極差可知，各考察因素對(duì)提取效果影響的大小順序?yàn)椋篊>B>A，即乙醇濃度>料液比>提取時(shí)間。最佳的提取工藝為C2B2A2，即乙醇濃度為60%，料液比為1∶30，提取時(shí)間為50 min。將試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。由表3可知，乙醇濃度、料液比和提取時(shí)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 茜草總黃酮提取正交試驗(yàn)因素水平表

表2 茜草總黃酮提取正交試驗(yàn)

表3 方差分析表

注：n=2

2.4 最佳條件的驗(yàn)證

準(zhǔn)確稱取石油醚脫脂后的茜草粉末3份，每份1.0 g，根據(jù)最佳提取工藝條件C2B2A2提取，按2.1項(xiàng)方法測(cè)定提取率，平均總黃酮提取率為2.730%。結(jié)果表明，根據(jù)最佳提取條件所得的總黃酮提取率均比正交設(shè)計(jì)表中其他提取條件下的總黃酮提取率高，3次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果RSD=1.05%，表明該工藝條件合理、穩(wěn)定、可行。

3 討論

單因素試驗(yàn)中，當(dāng)乙醇濃度高于60%時(shí)，茜草中的其他非黃酮類物質(zhì)也被更多地提取出來，特別是一些親脂性、醇溶性強(qiáng)的成分的溶出，加大了同黃酮類物質(zhì)的溶劑競(jìng)爭(zhēng)，使得總黃酮提取率下降[5]。

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法的有效結(jié)合，對(duì)超聲波提取血茜草中總黃酮的提取工藝條件進(jìn)行篩選，得到最佳提取工藝：乙醇濃度60%，料液比1∶30，提取時(shí)間50 min，在此條件下茜草總黃酮的提取率為2.730%。與文獻(xiàn)[3]報(bào)道的傳統(tǒng)回流方法比較，本方法具有提取效率高、節(jié)能、提取時(shí)間短、總黃酮提取率高、穩(wěn)定和易操作等優(yōu)點(diǎn)，是一種較理想的提取茜草總黃酮的方法。研究為進(jìn)一步推動(dòng)茜草總黃酮的利用、加大開發(fā)利用茜草資源提供科學(xué)參考。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京：中國(guó)科技醫(yī)藥出版社，2010：218-219.

[2] 斯琴畢力格，曲長(zhǎng)明，李增春.茜草中提取總黃酮實(shí)驗(yàn)微型法與常規(guī)法的比較[J].內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2008，23(3)：269-271.

[3] 田春蓮，蔣鳳開.茜草總黃酮提取工藝研究[J].食品科學(xué)，2011，32(24)：60-63.

[4] 白明生，陳彥云，李國(guó)旗.洋蔥皮總黃酮的超聲波提取工藝研究[J].食品科技，2008，33(12)：190-193.

[5] 陳文娟，陳建福.漳州血柚皮總黃酮超聲波輔助提取工藝研究[J].常熟理工學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué))，2012，26(4)：57-63.

OptimizationofUltrasonicExtractionProcessofTotalFlavonoidsinRubiaeRadixEtRhizoma

WANG Jian-zhuang1，SHI Yu-xuan2，ZHENG Rong-jie3，ZHOU Ye1，CHENG LI-hui1，LYU Hua-chong1*

(1.SchoolofPharmacy，GuangdongPharmacologicalUniversity，Guangzhou510006，China；2.DepartmentofPharmacy，SunYat-senMemorialHospital，SunYat-senUniversity，Guangzhou510120，China；3.DepartmentofPharmacy，theSecondPeople’sHospitalofGuangdong，Guangzhou510317，China)

Objective：To optimize the ultrasonic extraction process of total flavonoids in Rubiae Radix et Rhizoma.Methods：The effect factors to extraction rate including ethanol concentration，ratio of solid to liquid，extraction time，which measured by coloration method with alu minum nitrate，were investigated by single factor test，and the optimal conditions of extraction were obtained by orthogonal test.Results：The extraction rate of total flavonoids in Rubiae Radix et Rhizoma was 2.730% under the optimal extracting conditions：ethanol 60%，ratio of material to liquid 1∶30 and extraction time 50 min.Conclusion：Compared with traditional way，the optimized ultrasonic extraction process is efficient，rapid，simple，and stable.

Rubiae Radix et Rhizoma；Ultrasonic extraction；Total flavonoids；Orthogonal test

2013-08-12)

*

呂華沖，碩士生導(dǎo)師，副教授，主要從事天然藥物活性成分及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究；Tel：(020)39352140，E-mail：wjz506@163.com