利用COI基因序列鑒別賽加羚羊角與其代用品△

陳靜，蔣志剛 *

(1.中國科學(xué)院動物研究所 動物生態(tài)與保護生物學(xué)重點實驗室，北京 100101；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

利用COI基因序列鑒別賽加羚羊角與其代用品△

陳靜1,2，蔣志剛1,2 *

(1.中國科學(xué)院動物研究所 動物生態(tài)與保護生物學(xué)重點實驗室，北京 100101；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

目的：用COI序列作為分子標(biāo)記鑒定賽加羚羊角與其代用品山羊Caprahircus、綿羊Ovisaries、藏原羚Procaprapicticaudata、蒙原羚P.gutturosa、鵝喉羚Gazellasubgutturosa和藏羚Pantholopshodgsonii的角，為監(jiān)管羚羊角市場貿(mào)易和控制賽加羚羊角走私提供技術(shù)支持。方法：從3種不同類型的賽加羚羊角以及藏原羚、蒙原羚、鵝喉羚樣品中提取基因組DNA，設(shè)計巢式PCR體系，擴增349 bp COI片段，結(jié)合從GenBank中下載的序列構(gòu)建賽加羚羊及其代用品的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果：保存期1～2年的新鮮賽加羚羊角中提取出的基因組DNA濃度比陳舊羚羊角、羚羊角片的高，而陳舊羚羊角不同位置提取出的基因組DNA濃度差別較小。NJ樹上，7個物種分別單獨聚群，形成獨立的分枝，支持率都達(dá)到了99%以上。結(jié)論：DNA分子鑒定技術(shù)結(jié)合針對低濃度基因組DNA模板的巢式PCR反應(yīng)體系客觀準(zhǔn)確地區(qū)分了賽加羚羊角和其易混代用品。本研究不僅為賽加羚羊角的分子鑒定技術(shù)建立了操作方法，而且提供了參考序列，簡化了實際應(yīng)用中的鑒定流程，對賽加羚羊貿(mào)易監(jiān)管以及走私監(jiān)控具有實踐參考意義。

羚羊角；貿(mào)易；代用品；基因組DNA；COI；分子鑒定

羚羊角是?？苿游镔惣恿缪騍aigatatarica的角(以下簡稱羚羊角)，因具有清熱解毒等功效而被廣泛使用。19世紀(jì)60年代，分布于我國新疆地區(qū)的賽加羚種群因過度捕獵而滅絕[1]。前蘇聯(lián)解體后，分布于其他中亞國家的種群也由于盜獵、疾病等原因在短短幾年內(nèi)下降了90%[2]。1989年，賽加羚羊被列為國家一級重點保護野生動物，1995年，賽加羚羊被列為《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》(CITES)附錄Ⅱ物種。在我國民間，山羊Caprahircus、綿羊Ovisaries、藏原羚Procaprapicticaudata、蒙原羚Procapragutturosa、鵝喉羚Gazellasubgutturosa和藏羚Pantholopshodgsonii等的角可當(dāng)作賽加羚羊角的代用品使用[3]。中藥材市場上，羚羊角被制成粉末、絲條和片塊等形狀銷售，加上部分商販有意造假，羚羊角種類難以識別，給羚羊角貿(mào)易監(jiān)管帶來困難，也不利于監(jiān)控賽加羚羊等瀕危物種的盜獵和走私活動。目前已有的羚羊角鑒別方法包括形態(tài)比較、顯微結(jié)構(gòu)比較[4-5]、蛋白電泳法[6]、薄層色譜法[7]等。實踐中使用較多的是依賴經(jīng)驗判斷鑒定的形態(tài)比較法，相比之下，DNA分子鑒定技術(shù)具有成熟的、可重復(fù)的實驗和統(tǒng)計方法，更為準(zhǔn)確、實用。本研究采用COI(cytochrome oxidase subunit 1)基因片段作為分子標(biāo)記，探索并建立了賽加羚羊角及其易混代用品的分子鑒定方法，以期為羚羊角的市場監(jiān)管和相似羚羊類物種的保護提供可靠的種類鑒定技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

中國北京同仁堂(集團)有限責(zé)任公司提供了1份賽加羚羊角片以及1個儲存了30年以上的陳舊整角；1個1～2年的賽加羚羊新鮮整角由河北省林業(yè)廳提供；3個藏原羚樣品采集自青海??；2個蒙原羚標(biāo)本由內(nèi)蒙古自治區(qū)阿日哈沙特口岸提供；3個鵝喉羚樣品由新疆維吾爾自治區(qū)卡拉麥里自然保護區(qū)提供。其他COI基因序列來源于GenBank數(shù)據(jù)庫，見表1。

注：*保護等級：國家重點保護野生動物名錄中的保護等級，非名錄中物種為空白；**GenBank登錄號：從GenBank中下載的序列的登錄號，不包括本研究提交的登錄號。

1.2 基因組DNA提取

賽加羚羊角以及藏原羚、蒙原羚、鵝喉羚組織樣品基因組DNA均采用Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 (TaKaRa)提取。為驗證羚羊角DNA提取效果是否因取樣位置而異，分別從陳舊整角角尖、中部、根部以及骨塞處采集樣品提取DNA。使用NanoDrop 2000分光光度計 (Thermo Scientific)測定基因組DNA濃度。

1.3 巢式PCR引物設(shè)計、PCR擴增和測序

為從低濃度模板DNA中穩(wěn)定擴增COI序列，本研究根據(jù)賽加羚羊線粒體基因組DNA全序列(GenBank登錄號JN632700)設(shè)計了一套巢式PCR引物。兩對引物分別是：

外引物5COI(Forward： 5′-TGAGCCGGCATAG TAGGAAC-3′； Reverse： 5′-CCTGAGTAGTAGGTGAC AATGTG-3′)；

內(nèi)引物SaigaCOI(Forward：5′-GTAGTCGTAA CCGCACAT-3′；Reverse：5′-GTAGGAGGACAGCCGT AAT-3′)。

引物PCR反應(yīng)體系如下：1×PCR buffer，MgCl22.0 mmol·L-1，4種dNTP各0.2 mmol·L-1，引物各0.5 μmol·L-1，Ex Taq DNA 聚合酶(TaKaRa)0.025 units·μL-1以及2～20 ng·μL-1DNA模板。第一輪PCR反應(yīng)在20 μL體系下進行，反應(yīng)條件是：94 ℃ 7 min預(yù)變性，94 ℃ 30 s，52 ℃45 s，72 ℃ 1 min，20個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。第二輪PCR反應(yīng)中，取1 μL第一輪PCR產(chǎn)物作為模板，40 μL反應(yīng)體系，退火溫度為54 ℃，35個循環(huán)，其他條件與第一輪PCR相同。擴增產(chǎn)物送到北京諾賽基因組研究中心測序，所獲得序列登錄到GenBank中，登錄號為：KC679005、KC679006、KC679007、KC679011、KC679012、KC679014、KC679019、KC679020、KC679021、KC679028、KC679029。

1.4 數(shù)據(jù)分析

測序得到的COI序列用BioEdit(Ibis Bioscience)編輯，剪切掉兩端的模糊片段。用ClustalX 1.8.1軟件進行比對[8]。使用MEGA 4[10]構(gòu)建基于Kimura 2 parameter[9]模型的Neighbour-Joining 樹，系統(tǒng)樹各分支的置信度用自舉檢驗法(bootstrap)檢驗，共進行1 000次循環(huán)，以家牛Bostaurus(GenBank登錄號AF492351)為外群。

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA提取

從陳舊整角的不同位置以及經(jīng)過處理的賽加羚羊角片提取出的DNA濃度相當(dāng)，并且都遠(yuǎn)低于1～2年的新鮮賽加羚羊整角,見表2。

表2 賽加羚羊角中提取出的基因組DNA濃度

2.2 COI基因序列比較

研究運用巢式PCR技術(shù)從賽加羚羊角以及其易混代用品樣品中成功擴增了11條400 bp的COI序列，并從GenBank中獲得另外13條序列，經(jīng)剪切后序列長度為349 bp。全部24條序列進行比對后，其中保守位點有243個，多態(tài)性位點有106個，平均核苷酸頻率為A(26.2%)、T(31.0%)、C(28.0%)，G(14.9%)。

2.3 種間系統(tǒng)發(fā)育樹

在鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，賽加羚羊的4個樣品單獨聚為一支，支持率為100%。其他6種動物的COI序列也分別單獨聚群，形成獨立的分枝，支持率都達(dá)到了99%以上。在其他6種動物中，藏原羚、蒙原羚、鵝喉羚與賽加羚羊同屬于羚羊亞科，藏羚、綿羊、山羊?qū)儆谘騺喛?，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。COI序列構(gòu)建的NJ樹明顯地區(qū)分了賽加羚羊與其易混品，并且無論親緣關(guān)系遠(yuǎn)近都有很好的鑒別效果。見圖1。

圖1 依據(jù)349 bp COI序列構(gòu)建的賽加羚及其易混代用品系統(tǒng)發(fā)育NJ樹

3 討論

羚羊角是高度角質(zhì)化的真皮組織，質(zhì)地堅韌，細(xì)胞含量少，從其中提取基因組DNA比較困難，而市場上存放多年的陳舊羚羊角以及經(jīng)過加工處理后的羚羊角片、羚羊角粉中的基因組DNA降解嚴(yán)重。因市場上的羚羊角大多是20年以上的庫存，本研究分析了陳舊整角不同部位以及新鮮羚羊角的基因組DNA提取效果的差異，以期對羚羊角的市場監(jiān)管有實際的指導(dǎo)意義。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，取自新鮮賽加羚羊角根部的樣品提取的基因組DNA濃度很高，完全可以滿足PCR反應(yīng)需要，而對于陳舊樣品，無論樣品取自整角的角尖、中部、根部還是骨塞，基因組DNA濃度都很低，無法用常規(guī)PCR反應(yīng)進行擴增。因此，研究中設(shè)計了針對于低濃度模板DNA的巢式PCR擴增體系，通過一對外引物進行擴增以富集目的片段，再用第二對內(nèi)引物進行PCR反應(yīng)，成功地從低濃度基因組DNA中擴增了349 bp COI序列，并且構(gòu)建了賽加羚、藏原羚、蒙原羚、鵝喉羚、藏羚、綿羊、山羊的系統(tǒng)發(fā)育樹，直觀、正確地區(qū)分了賽加羚羊與其代用品，為利用DNA分子鑒定技術(shù)鑒別賽加羚及其代用品構(gòu)建了實驗操作方法，提供了參考序列。

目前國內(nèi)的賽加羚羊角原料絕大部分依靠庫存原料，合法原料供應(yīng)越來越少，為了獲得高額利潤，賽加羚羊角走私案件時有發(fā)生[11]，研究建立的賽加羚羊角DNA分子鑒定技術(shù)可以用于賽加羚羊角走私案件的法醫(yī)鑒定，為打擊賽加羚羊偷獵和走私提供了一個有效的技術(shù)手段。另外，由于賽加羚羊角與其代用品整角外形相似，刨片或者磨粉之后更加難以區(qū)分，部分藥材商以次充好、以假摻真[12]，嚴(yán)重?fù)p害了消費者的利益，本研究建立的利用COI序列鑒定賽加羚羊與其易混代用品的方法也可以為羚羊角市場貿(mào)易監(jiān)測與管理提供可靠的技術(shù)支持。CITES公約締約國大會已將只分布于蒙古的、原來為賽加羚羊一個亞種的北方賽加羚羊亞種S.t.mongolica作為單獨的物種，北方賽加羚羊S.borealis列入CITES附錄，北方賽加羚與賽加羚這兩個物種的區(qū)分方法尚需進一步研究。

致謝：中華人民共和國瀕危物種科學(xué)委員會辦公室孟智斌先生、曾巖博士、平曉鴿博士對文章提出寶貴意見并協(xié)助采集樣品，新疆阿勒泰地區(qū)林業(yè)局初紅軍博士提供鵝喉羚樣品，河北省林業(yè)廳武明錄先生以及中國北京同仁堂(集團)有限責(zé)任公司提供賽加羚羊角樣品，東北師范大學(xué)劉炳萬博士提供蒙原羚樣品，在此謹(jǐn)致謝意！

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DiscriminationofSaigaAntelopeHornfromSubstitutesin“Lingyangjiao”MarketsbyGeneticIdentificationTechnology

CHEN Jing1,2,JIANG Zhi-gang1,2*

(1.KeyLaboratoryofAnimalEcologyandConservationBiology,InstituteofZoology,ChineseAcademyofSciences,Beijing100101,China；2.UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China)

Objective： Employ genetic species identification technology to distinguish Saiga antelope horns from the substitutes in Traditional Chinese Medicine (TCM) markets,including horns of goat (Caprahircus),sheep (Ovisaries),Tibetan gazelle (Procaprapicticaudata),Mongolia gazelle (Procapragutturosa),Goitere d gazelle (Gazellasubgutturosa) and Tibetan antelope (Pantholopshodgsonii). Those substitutes were morphologically similar to Saiga horn,especially when they were processed,for instance,when the horns were grinded into powder,chopped into slides and segments. The final aim of this study was to facilitate the management of TCM markets of “Lingyangjiao” and control Saiga antelope or other endangered Chinese gazelles smuggling.Methods： Genomic DNA was extracted from three Saiga horn samples and samples of Goitered gazelle,Tibetan gazelle and Mongolia gazelle. Two newly designed primer sets were used to amplify COI fragments of 349 bp with nest-PCR systems. Phylogenetic NJ tree of saiga antelope and six substituted species was constructed using the sequences of this study and those retrieved from GenBank.Results： Genomic DNA extracted from different parts of the timeworn Saiga horn,such as the tip,middle part and the base,were low,as well as the processed horn block,whereas concentration of DNA from the new Saiga antelope horn was much higher. In NJ tree,all the seven “Lingyangjiao” species formed independent clades with >99% support values.Conclusion： Combining with nest-PCR systems,molecular diagnosis technology using COI gene as markers proved to be a powerful tool to discriminate Saiga antelope horns from the other “Lingyangjiao” species,especially when dealing with degraded samples from processed or timeworn horns. With the diagnostic protocol and reference sequences provided in this study,identification of biological origins of “Lingyangjiao” sold in TCM could be simplified. The technology might contribute to monitoring the trade of Saiga antelope and controlling Saiga antelope and the other endangered Chinese gazelle smuggling.

Lingyangjiao； TCM； Molecular Diagnosis； COI； Substitutes

2013-01-10)

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中國科學(xué)院知識創(chuàng)新工程重要方向項目——重要CITES附錄物種資源評估及致危機理(KSCX2-EW-Z-4)；自然科學(xué)基金面上基金(31070469)；科技基礎(chǔ)性工作專項重大項目(2013FY110300)

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蔣志剛，Tel：(010)64807268，E-mail：jiangzg@ioz.ac.cn