吲哚青綠介導光動力療法治療兔眼后發(fā)性白內(nèi)障中視網(wǎng)膜的毒性觀察＊

梁毓琳，李 蘭△，張遠平，李云川，查 旭，戴紅梅，曹 倩，李靜華，楊文艷

（1.云南省昆明市第一人民醫(yī)院眼科 650034；2.昆明醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院眼科，昆明 650000）

吲哚青綠染料（indocyanine green，ICG）是一種水溶性無毒三碳菁燃料，曾廣泛應用于眼科各類疾病的檢查診斷中。近年來，由于后發(fā)性白內(nèi)障已成為影響白內(nèi)障患者術(shù)后擁有良好視力的主要因素，在研究后發(fā)障的實驗中，ICG被作為一種光敏劑使用，并于動物實驗及體外實驗中取得了較好的治療效果。Melendez的體外實驗證實，ICG對晶狀體上皮細胞具有光動力毒性，并呈劑量依賴性。在近幾年對白內(nèi)障術(shù)后的后發(fā)障治療中，寄予了吲哚青綠更多的期望并加強了對其臨床及基礎(chǔ)方面的研究。本研究在利用ICG介導光動力治療后發(fā)障實驗中，通過透射電鏡觀察視網(wǎng)膜有無損傷，了解在ICG介導激光治療后發(fā)障實驗中后對視網(wǎng)膜有無不良反應。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 32只新西蘭兔，雌雄兼?zhèn)?，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，隨機分為對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組8只。

1.2 方法

1.2.1 記錄儀器 重慶艾爾曦醫(yī)療器械設(shè)備有限公司生產(chǎn)的IVE 205A電生理檢查儀。

1.2.2 刺激參數(shù) 采用全視野閃光刺激器，白光刺激，刺激強度為1.6cd·m-2·s-1。

1.2.3 實驗步驟 分組后的新西蘭兔，行晶狀體超聲乳化手術(shù)，術(shù)前房內(nèi)注入0.5mL濃度分別為1.25mg／mL（低劑量組），2.5mg／mL（中劑量組），5mg／mL（高劑量組）的ICG后分別注入氣體，使氣體泡與角膜內(nèi)皮相接觸，隔離ICG與角膜內(nèi)皮的接觸，用810nm的半導體激光對囊膜進行低能量（50 mW／cm）照射2min后完畢，沖洗出ICG，關(guān)閉切口。術(shù)后3個月，按晶狀體后囊增生混濁程度并分級，分級標準：按Odrich后囊膜混濁分級法（0級為透明；l級為輕度混濁，能看清眼底或混濁面積小于1／2后囊膜面積；2級為中度混濁，能模糊看見眼底或混濁面積大于1／2后囊膜面積；3級為完全混濁，不能看見眼底。

再對兔眼行閃光視覺誘發(fā)電位檢查。在視區(qū)皮層記錄到主要成分為NPN的3相波，其中，P波的出現(xiàn)率為100%，潛伏期最穩(wěn)定，幅值也較高。故本試驗只測量P波的潛伏期、波幅、時程。檢查方法為均選取右眼電極，所有家兔均在清醒狀態(tài)下，充分散瞳中后于暗室內(nèi)放置30min，支架固定頭部，室溫18～24℃。記錄電極刺于后枕區(qū)皮下，枕骨粗隆左右旁開0.5 cm處，參考電極刺于乳突處皮下，接地電極刺于鼻根處［1］。檢查結(jié)束后處死動物，取出眼球，制作透射電鏡視網(wǎng)膜標本。最后分別觀察不同組別兔眼視網(wǎng)膜損傷情況。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以表示，兔眼晶狀體后發(fā)障程度觀察結(jié)果采用χ2檢驗，兔眼閃光視覺誘發(fā)電位P波采用配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

術(shù)后3個月，各組兔眼晶狀體后發(fā)障程度觀察結(jié)果（χ2=122.49），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 術(shù)后第3個月晶狀體后囊膜混濁情況（n=8）

圖1 視網(wǎng)膜電鏡圖片

經(jīng)閃光視覺誘發(fā)電位檢測，實驗各組兔眼閃光視覺誘發(fā)電位P波經(jīng)配對t檢驗潛伏期（t=0.374，r=0.033），波幅（t=2.187，r=0.251）、時程（t=1.766，r=0.566）與對照組比較均無較大差異（P＞0.05）。見表2。

表2 各組閃光視覺誘發(fā)電位的P波潛伏期、波幅、時程（，n=8）

表2 各組閃光視覺誘發(fā)電位的P波潛伏期、波幅、時程（，n=8）

組別 潛伏期 波幅 時程對照組113.37±15.25 8.85±1.90 68.58±7.99低劑量組 111.01±8.81 10.54±1.64 63.94±7.97中劑量組 105.13±14.22 9.60±1.57 60.01±8.59高劑量組110.64±12.33 9.75±2.31 63.07±5.39

視網(wǎng)膜透射電鏡檢查可見使用ICG各組兔眼視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)均有不同程度損傷，以神經(jīng)節(jié)細胞，膜盤水腫，以及線粒體損傷較明顯，其中低劑量組兔眼視網(wǎng)膜損傷相對較輕，雙極細胞與水平細胞胞質(zhì)存在。RPE細胞層呈單細胞排列無水腫等改變，與視網(wǎng)膜神經(jīng)層黏附良好，損傷層次局限于視錐細胞層。而中劑量組及高劑量組則可見視網(wǎng)膜全層均有不同程度損傷。對照組視網(wǎng)膜各層未見損傷，見圖1。

3 結(jié) 論

ICG原被用于視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜血管造影四十年，因其分子大，可與蛋白結(jié)合，對光敏感，吸收峰（805nm）與傳統(tǒng)半導體激光波長（810nm）相近，皮膚光毒性低，組織靶向性高，生物分布和清除迅速，使用操作簡單等特點使近年來其眼科用途逐漸擴大，已廣泛用于眼底視網(wǎng)膜手術(shù)中。但目前經(jīng)臨床隨訪和實驗研究發(fā)現(xiàn)ICG在眼內(nèi)使用，無論是單獨使用或聯(lián)合光照都具有潛在的神經(jīng)毒性和視網(wǎng)膜毒性［2-3］。Rezai等［4］研究發(fā)現(xiàn)，ICG作用于RPE后明顯提高其凋亡率。Haritoglou等［5］對10例ICG染色后剝除的內(nèi)界膜用透射電子顯微鏡進行分析顯示，視網(wǎng)膜內(nèi)界膜面有Muller細胞的損傷和細胞破裂。推測與ICG屬于高分子物質(zhì)，具有很強的親水性，溶解后包漿滲透提高，造成細胞水腫有關(guān)。王文瑩等［6］發(fā)現(xiàn)，ICG對體外培養(yǎng)RPE細胞生長有明顯抑制作用并呈濃度和時間依賴性。考慮為體內(nèi)多種細胞可主動轉(zhuǎn)運攝取ICG，導致細胞內(nèi)ICG濃度較高后細胞水腫。多項實驗證明了ICG長期存留對眼組織有潛在的危險［7］。國內(nèi)何曉靜等［8］研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)光動力治療后，細胞外節(jié)段排列輕微紊亂，RPE細胞輕微內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，其內(nèi)可見髓樣小體?？紤]機制為當激光作用于視網(wǎng)膜時，視網(wǎng)膜色素上皮的損傷，色素屏障受得破壞，結(jié)果提示能量能對光感受器和色素上皮起作用［9］。宋志杰等［10］在使用ICG染色視網(wǎng)膜內(nèi)界膜治療黃斑裂孔時亦發(fā)現(xiàn)其藥物毒性與劑量呈相關(guān)，并隨隨訪時間的延長，視網(wǎng)膜水腫能夠逐漸減輕。李雁杰等［11］研究亦發(fā)現(xiàn)無論是低濃度還是高濃度的ICG直接用于都會對視網(wǎng)膜造成損傷。

本實驗中ICG雖不直接作用于眼底，但藥物滯留于后囊膜3個月，通過緩慢代謝，可能有部分ICG彌散到玻璃體腔及視網(wǎng)膜前造成損害，并可能隨濃度增加和作用時間延長，對細胞毒性作用逐漸增強。為了解ICG引導光動力治療后發(fā)障后是否也存在對視網(wǎng)膜細胞的毒性作用，從而更加全面評價本實驗的治療價值和不良反應，對不同藥物濃度組別分別觀察視網(wǎng)膜電鏡結(jié)果，同時行閃光視覺誘發(fā)電位檢查。本實驗設(shè)立了手術(shù)對照組，目的是為了了解手術(shù)是否會對視網(wǎng)膜造成損傷。手術(shù)對照組術(shù)后3個月電鏡顯示視網(wǎng)膜各層排列整齊、層次清晰，與正常兔眼視網(wǎng)膜電鏡圖片對比未見明顯結(jié)構(gòu)改變。說明該手術(shù)對視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)無明顯影響。

本實驗表明，利用ICG介導的光動力作用在治療兔眼后發(fā)障有效的同時，因ICG緩慢的彌散至玻璃體腔，不同濃度的ICG組均能對視網(wǎng)膜造成損傷，并呈劑量相關(guān)。低劑量組損傷較輕，高劑量組則損傷相對增多，在本實驗中以濃度為1.25 mg／mL ICG治療時損傷最少。結(jié)果與各類實驗中將ICG直接用于視網(wǎng)膜前結(jié)果類似。同時實驗各組未造成RPE的脫離及細胞凋亡，閃光視覺誘發(fā)電位與對照組P波潛伏期，波幅及時程比較均無明顯差異，且與正常兔眼閃光視覺誘發(fā)電位實驗值較為接近［12］?？煽紤]今后在進一步利用ICG介導光動力防治晶狀體后發(fā)障時，采用低濃度組治療，以在取得治療效果的同時將視網(wǎng)膜損傷降為最低。

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