超聲波處理對(duì)黃豆種子萌發(fā)過(guò)程的影響

趙萌萌，崔向軍，汪 斌，劉旭輝

（蘭州交通大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

黃豆芽（soybean sprouts）是中國(guó)人喜食的一種傳統(tǒng)優(yōu)質(zhì)蔬菜。在黃豆芽的生產(chǎn)過(guò)程中，人們?yōu)榱颂岣唿S豆的萌發(fā)率、防止其腐爛而大量使用化學(xué)試劑（如：亞硝酸鹽、尿素等），該方法生產(chǎn)出的黃豆芽不但營(yíng)養(yǎng)價(jià)值下降，而且對(duì)身體健康有害。市場(chǎng)上的“毒豆芽”事件，讓人們更加關(guān)注黃豆芽的安全生產(chǎn)。近年來(lái)，超聲波作為一種無(wú)公害的物理處理手段在生物科學(xué)領(lǐng)域已得到了廣泛的應(yīng)用，植物種子經(jīng)超聲波處理后，可以提高種子活力、促進(jìn)種子萌發(fā)及幼苗的生長(zhǎng)、增加種子的抗逆能力及作物產(chǎn)量[1-4]。試驗(yàn)采用超聲波處理黃豆，研究其發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)及黃酮、Vc 等營(yíng)養(yǎng)成分的含量變化，分析了超聲波處理對(duì)黃豆萌發(fā)過(guò)程的影響，以期找到一種既能促進(jìn)種子萌發(fā)又能提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的黃豆芽生產(chǎn)新技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮黃豆，取顆粒飽滿(mǎn)、有光澤、無(wú)生理缺陷、大小均一的黃豆，分成若干等份供試用。蒽酮試劑、DNS 試劑、福林試劑、考馬斯亮藍(lán)G250、蘆丁、維生素C、硫脲、2，4-二硝基苯肼，三氯醋酸、酪素、Al（NO3）3、NaNO2等為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

722 型分光光度計(jì)，超聲波清洗儀（KQ3200E型，40 kHz，150W），高速離心機(jī)等。

1.3 方 法

1.3.1 黃豆萌發(fā)率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)及胚軸長(zhǎng)度和重量的測(cè)定 將預(yù)挑選的黃豆經(jīng)70%酒精溶液浸泡滅菌15 min 后，用蒸餾水洗滌5～6 遍，置于錐形瓶中加入500 mL 蒸餾水，放入恒溫水浴鍋中在25℃條件下浸泡6 h。然后放入超聲波清洗儀中進(jìn)行處理，處理時(shí)間設(shè)置為0（CK）、10 min（T1）、15 min（T2）、20 min（T3）、25 min（T4）、30 min（T5）6 個(gè)組，3 次重復(fù)[5-6]。

最后將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的試驗(yàn)樣品放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每隔24 h 加蒸餾水20 mL，并依次測(cè)量其萌發(fā)率（胚軸突破種皮1 mm 即為萌發(fā)）、胚軸長(zhǎng)度和重量，計(jì)算各組中黃豆芽平均長(zhǎng)度和重量，依次測(cè)量5 d，每組重復(fù)3 次。計(jì)算發(fā)芽率G（正常發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)）、發(fā)芽指數(shù)GI（發(fā)芽種子數(shù)/發(fā)芽天數(shù)）、活力指數(shù)VI（發(fā)芽指數(shù)×胚軸總長(zhǎng)）[7-8]。

1.3.2 可溶性糖含量的測(cè)定 采用蒽酮法測(cè)定可溶性糖含量[9]。

1.3.3 淀粉酶活力的測(cè)定 采用3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定總淀粉酶活力[10-11]。

1.3.4 黃酮含量的測(cè)定 以NaNO2-Al（NO3）3為顯色劑，利用其與黃酮類(lèi)物質(zhì)生成的紅色鋁螯合物為特征，在510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，并以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)照，從而得到待測(cè)物質(zhì)的總黃酮含量[12-13]。

1.3.5 Vc 含量的測(cè)定 采用2，4-二硝基苯肼法測(cè)定Vc 含量[14-15]。

1.3.6 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[16-17]。

1.3.7 蛋白酶活力的測(cè)定 參考凌猛等[18]、Hemalatha 等[19]的方法，并經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)。取25℃條件下萌發(fā)的黃豆鮮重1 g 于研缽中，加入2 mL 磷酸緩沖液研成勻漿，移至離心管，用8 mL 磷酸緩沖液分次洗滌研缽，收集洗滌液，置于40℃水浴保溫并攪拌1 h 后，4 000 r /min 離心15 min，所得上清液即為粗酶液。

取6 支干燥潔凈試管，吸取上述粗酶液各1 mL，向空白管中加2 mL 三氯醋酸溶液，其他5 管作為測(cè)試管各加入1 mL 酪素，搖勻，40℃保溫10 min。取出試管，向5 支測(cè)試管中各加入2 mL 三氯乙酸，空白管中加入1 mL 酪素，靜置10 min，過(guò)濾沉淀。各取1 mL 濾液，分別加0.4 mol/L 的Na2CO35 mL，福林試劑1 mL，在40℃顯色20 min。以空白管調(diào)零，在680 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記錄結(jié)果，根據(jù)回歸方程計(jì)算測(cè)量液中蛋白酶的活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波處理對(duì)黃豆萌發(fā)率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、胚軸長(zhǎng)度、重量的影響

從表1 中可以看出，在25℃恒溫培養(yǎng)下，其他影響萌發(fā)的因子均采取相同的最適條件，黃豆萌發(fā)24 h、36 h 時(shí)，所有超聲波處理組的萌發(fā)率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)都明顯高于對(duì)照組。其中，T4 組36 h時(shí)黃豆的萌發(fā)率接近100%，其發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)也遠(yuǎn)高于其他處理組，發(fā)芽指數(shù)比對(duì)照組增加1.08 倍，活力指數(shù)比對(duì)照組高345.0%。

表1 超聲波處理對(duì)黃豆發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)的影響

從圖1 中可以看出，經(jīng)超聲波處理的黃豆胚軸長(zhǎng)度（芽長(zhǎng)）明顯大于CK 組，觀察直線(xiàn)斜率可知，第3 天、第4 天黃豆芽的生長(zhǎng)速度最快。5 d 后T4 組胚軸長(zhǎng)度達(dá)52.27 mm，比對(duì)照組長(zhǎng)49.77%。

圖1 超聲波處理對(duì)黃豆芽芽長(zhǎng)的影響

從圖2 中可知，黃豆在萌發(fā)過(guò)程中其重量隨萌發(fā)時(shí)間延長(zhǎng)而增加，且試驗(yàn)組黃豆芽的重量都明顯高于對(duì)照組。5 d 后，T4 組黃豆芽的平均重量為0.91 g，比對(duì)照組重12.35%。

圖2 超聲波處理對(duì)黃豆芽重量的影響

2.2 超聲波處理對(duì)可溶性糖含量的影響

從圖3 中可以看出，黃豆萌發(fā)時(shí)分解糖類(lèi)提供能量，所以糖的含量隨著萌發(fā)時(shí)間的推移逐漸減少。其中，試驗(yàn)組在萌發(fā)過(guò)程中可溶性糖的含量始終高于對(duì)照組，說(shuō)明超生波處理后黃豆種子分解淀粉的速度均比對(duì)照組快，產(chǎn)生的可溶性糖也多。從而為后期豆芽的快速生長(zhǎng)提供了足夠的能量來(lái)源。其中，超聲波處理25 min 效果最理想。

圖3 超聲波處理對(duì)黃豆芽可溶性糖含量的影響

2.3 超聲波處理對(duì)總淀粉酶活力的影響

從圖4 中可以看出，總淀粉酶活力隨萌發(fā)時(shí)間推移而增加，第1 天內(nèi)淀粉酶活力增長(zhǎng)最快，從第3 天開(kāi)始淀粉酶活力增長(zhǎng)變慢，逐漸趨于穩(wěn)定。在萌發(fā)過(guò)程中，試驗(yàn)組的淀粉酶活力始終高于對(duì)照組，從而使黃豆中更多的淀粉被利用，可溶性糖含量增加，這也從側(cè)面印證了上述黃豆萌發(fā)過(guò)程中可溶性糖含量的變化情況。其中，超聲波處理25 min的促進(jìn)效果最明顯。

圖4 超聲波處理對(duì)黃豆芽淀粉酶活力的影響

2.4 超聲波處理對(duì)黃酮含量的影響

從圖5 中可知，黃豆萌發(fā)第1 天、第2 天內(nèi)總黃酮含量迅速增加，第3 天增長(zhǎng)速度減緩，T4 組黃酮含量最高，可達(dá)153.31 ug/g，第4 天后開(kāi)始迅速減少。原因可能是萌發(fā)前期黃酮類(lèi)物質(zhì)大量合成，第4 天開(kāi)始細(xì)胞內(nèi)合成后期代謝產(chǎn)物，中間代謝物黃酮被大量利用，因此含量迅速降低。T4 組黃豆在萌發(fā)過(guò)程中黃酮的合成和分解速率都是最快的。

圖5 超聲波處理對(duì)黃芽黃酮含量的影響

2.5 超聲波處理對(duì)維生素c 含量的影響

從圖6 中可以看出，黃豆種子中的Vc 含量原本很低，但在萌發(fā)過(guò)程中，Vc 含量隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)而迅速增加。5 d 后，除對(duì)照組Vc 的含量略有下降的趨勢(shì)之外，試驗(yàn)組的Vc 含量均繼續(xù)升高。原因可能是種子萌發(fā)過(guò)程中，其內(nèi)部參與物質(zhì)代謝的酶類(lèi)隨之產(chǎn)生和被活化，參與Vc 合成的酶活性也隨之增強(qiáng)，豆芽組織中Vc 含量不斷增多。因此，超聲波處理不但有利于提高參與Vc 合成代謝的酶活力，而且還可以延長(zhǎng)豆芽保質(zhì)期，使其中Vc的含量保持較長(zhǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)。其中，以超聲波處理25 min 效果最佳。

圖6 超聲波處理對(duì)黃豆芽Vc 含量的影響

2.6 超聲波處理對(duì)蛋白質(zhì)含量的影響

從圖7 中可以看出，在黃豆萌發(fā)過(guò)程中，蛋白質(zhì)含量隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，直到第4 天下降速度才開(kāi)始減緩。原因是黃豆在萌發(fā)過(guò)程中，蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下分解為氨基酸而導(dǎo)致含量降低。說(shuō)明超聲波處理能加速黃豆萌發(fā)過(guò)程蛋白質(zhì)的降解，產(chǎn)生的小分子氨基酸更有利于人體吸收。

圖7 超聲波處理對(duì)黃豆芽蛋白質(zhì)含量的影響

2.7 超聲波處理對(duì)蛋白酶活力的影響

圖8 超聲波處理對(duì)黃豆芽蛋白酶活力的影響

從圖8 中可以看出，黃豆在萌發(fā)過(guò)程中，蛋白酶活力先增后降，第3 天內(nèi)增長(zhǎng)速度最快且酶活達(dá)最大值。其中，T4 組酶活力最高可達(dá)59.28 U/mg，是CK 組的1.37 倍。蛋白酶活力高可使黃豆中的蛋白質(zhì)更多的被降解為氨基酸，與黃豆在萌發(fā)過(guò)程中蛋白質(zhì)含量的變化相符。

3 結(jié) 論

試驗(yàn)結(jié)果表明：用一定時(shí)間劑量的超聲波處理黃豆種子后，可顯著提高其萌發(fā)率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)，并且可以改良萌發(fā)后黃豆芽的品質(zhì)，使其中重要營(yíng)養(yǎng)成分的含量大幅增加。其原因可能正是超聲波導(dǎo)致種子細(xì)胞的壁和質(zhì)膜透性發(fā)生可逆性改變，環(huán)境溫度升高，促使關(guān)鍵酶活性增加，誘導(dǎo)酶產(chǎn)生，種子中儲(chǔ)藏的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解和新?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的合成大大加快，使種子萌發(fā)生長(zhǎng)加快，其營(yíng)養(yǎng)成分的含量也大大增加。另外，由于超聲波的這種促萌發(fā)作用，使得豆芽的生長(zhǎng)時(shí)間縮短，可有效的防止?fàn)€根現(xiàn)象，延長(zhǎng)豆芽的保質(zhì)期。根據(jù)豆芽中營(yíng)養(yǎng)成分（如黃酮、Vc 等）含量的變化，同時(shí)從培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短以及簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、可推廣的角度綜合考慮，黃豆的最佳超聲波預(yù)處理時(shí)間應(yīng)為25 min，最佳培養(yǎng)時(shí)間為3 d。

[1]楊紅兵.超聲技術(shù)在農(nóng)業(yè)上是應(yīng)用現(xiàn)狀與前景[J].農(nóng)機(jī)化研究，2004，（1）：202-2041．

[2]馮 璐.植物育種的物理學(xué)方法[J].草業(yè)科學(xué)，2005，22（12）：63-661.

[3]董匯澤，楊君麗，張生菊.超聲波對(duì)野生柴胡種子萌發(fā)及活力的影響[J].中國(guó)種業(yè)，2005，（12）：46-471.

[4]李 剛，王乃亮.超聲波處理對(duì)當(dāng)歸種子萌發(fā)及活力的影響[J].西北師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，43（3）：75-77，84.

[5]楊紅兵，丁為民，陳坤杰，等.超聲技術(shù)在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用現(xiàn)狀與前景[J].農(nóng)機(jī)化研究，2004，（1）：202-204.

[6]史鋒厚，朱燦燦，沈永寶，等.超聲波與滲透調(diào)節(jié)處理對(duì)油松種子萌發(fā)的影響[J].浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，28（4）：545-549.

[7]張衛(wèi)華，董匯澤.超聲波處理抱莖獐牙菜種子萌發(fā)試驗(yàn)研究[J].青海大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，2（2）：57-59.

[8]莊南生，王 英，唐燕瓊，等.超聲波處理柱花草種子的生物學(xué)效應(yīng)研究[J].草業(yè)科學(xué)，2006，28（3）：80-81.

[9]王宏軍，鄧旭明，蔣 紅，等.蒽酮-硫酸比色法檢測(cè)多糖條件的優(yōu)化[J].中國(guó)飼料，2011，（4）：39-41.

[10]朱廣廉，鐘誨文，張愛(ài)琴.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：北京大學(xué)出版社，1990：175-178.

[11]馬永強(qiáng)，韓春然，方 蕾.玉米萌發(fā)過(guò)程中淀粉酶性質(zhì)的研究[J].食品科學(xué)，2007，28（11）：294-297.

[12]元曉梅，蔣明蔚，胡正芝.聚酰胺吸附-硝酸鋁顯色法測(cè)定山楂及山楂制品中的總黃酮含量[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，l996（4）：27-31.

[13]劉江雛，周榮琪.竹葉提取物總黃酮含量測(cè)定方法的改進(jìn)[J].食品科技，2005，（7）：77-79.

[14]楊艷杰，秦明利.紅棗干制過(guò)程中Vc 含量測(cè)定分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（15）：6516，6599.

[15]袁葉飛，甄漢深，歐賢紅.分光光度法測(cè)定大棗中的Vc 含量[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，25（2）：40-41.

[16]Zuo S S，Lundahl P.Amicro-Bradford membrane protein assay[J].Analyt.Biochem，2005，284：162-164.

[17]Chial H J，Thompson H B，Splittgerber A G.A spectral study of the charge forms of Coomassis Blue G250[J].Analyt.Biochem.2003，209：258-266.

[18]凌 猛，祖國(guó)仁，趙長(zhǎng)新.不同發(fā)芽條件下日本大米酶活力及水溶性蛋白變化規(guī)律的研究[J].食品工業(yè)科技，2010（5）：129-131.

[19]Hemalatha K，Sivaprasad D.Changes in the metabolism of protein during germination of sesame（Sesamum indicun l.）seeds[J].Plant Foods Hum Nutr，2003，58：1-10.