?；撬釋μ﹪⒓y蛙體內(nèi)消化酶活力的影響

莊建洲，頡志剛，凌 云

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院生態(tài)所，浙江 金華 321004）

?；撬幔═aurine）是一種條件性必需氨基酸，間接參與營養(yǎng)代謝、免疫等多種生理反應(yīng)。動物自身合成?；撬岬哪芰σ蛭锓N而異，這與體內(nèi)是否存在合成?；撬岬年P(guān)鍵酶——半胱亞磺酸脫羧酶（Cysteine Sulfinate Decarboxylase，CSAD）有關(guān)。肉食性動物通常容易缺乏?；撬?，而蛙類是典型的肉食性動物，在養(yǎng)殖條件下因食物組成的改變經(jīng)常會導(dǎo)致蛙的營養(yǎng)性疾病[1]。

泰國虎紋蛙（Rana tigrina cantor）是一種大型的經(jīng)濟(jì)食用蛙，經(jīng)過長期人工馴化能夠攝食人工配合飼料。然而，由于飼料成本問題，商品化飼料原料中富含?；撬岬聂~粉等動物性蛋白成分含量日趨減少，因此蛙類飼料內(nèi)需要添加適量的?；撬醽頋M足其生長發(fā)育的需要。國內(nèi)外關(guān)于蛙類對牛磺酸需求量的研究尚不多見。采用人工灌胃的方法，研究了?；撬釋μ﹪⒓y蛙肝臟和腸道蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力的影響，以此來評估泰國虎紋蛙對?；撬岬男枨罅?，旨在為飼料配方的改進(jìn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

養(yǎng)殖泰國虎紋蛙購自浙江省金華市水產(chǎn)市場，飼養(yǎng)在80 cm × 35 cm × 50 cm 玻璃缸中（10 只/缸）進(jìn)行馴化。水溫控制在（25±1）℃，提供遮蔽物和食臺，每天投喂活體黃粉蟲（Tenebrio molitor）1 次，隔天用經(jīng)曝氣脫氯的自來水換水1/3 體積。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 濃度梯度試驗(yàn) 馴化2 周后，虎紋蛙饑餓2 d 以排空胃內(nèi)殘余食物。選擇28 只體重相近、體質(zhì)健康的泰國虎紋蛙（75.77±1.66）g，隨機(jī)分成7 組（4 只/組），用裝有盾形針頭的注射器作為灌喂裝置，分別給各組蛙灌胃不同濃度的牛磺酸溶液（0～1.8 mg/mL，牛磺酸溶解于蒸餾水），劑量為1 mL/50 g 體重。連續(xù)灌喂5 d 后，蛙經(jīng)毀髓后迅速解剖，取肝臟和腸道組織用于測定消化酶活力。

1.2.2 時間梯度試驗(yàn) 給44 只蛙以特定濃度0.8 mg/mL 進(jìn)行灌喂，分別在灌胃0、1、2、3、4、5、6、7、8、10、12 h 后取3 只個體用于酶活力測定。

1.3 測定方法

1.3.1 蛋白酶活力測定 蛋白酶活力測定采用福林-酚試劑法[2-3]。以每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1 個蛋白酶比活力單位（mU/mgprot，pH值8.0 和溫度25 ℃）。

1.3.2 脂肪酶活力測定 脂肪酶活力測定參照Rungkan 等[4]提供的方法。以每分鐘產(chǎn)生1 μmol 對硝基苯酚（p-NP）的酶量定義為1 個脂肪酶比活力單位（mU/mgprot，pH 值7.5 和溫度25 ℃）。

1.3.3 淀粉酶活力測定 淀粉酶活力測定采用3,5-二硝基水楊酸顯色法。以每分鐘催化可溶性淀粉產(chǎn)生1 μg 麥芽糖的酶量作為1 個淀粉酶比活力單位（mU/mgprot，pH 值6.9 和溫度25 ℃）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean ±SE）表示。組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）檢驗(yàn)，并進(jìn)行LSD 多重比較。顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度牛磺酸對虎紋蛙消化酶活力的影響

圖1 不同濃度?；撬釋Φ鞍酌富盍Φ挠绊?/p>

2.1.1 蛋白酶活力 如圖1 所示，當(dāng)?；撬峁辔笣舛葹? mg/mL 時，肝蛋白酶活力達(dá)到峰值，且顯著高于對照組（0 mg/mL）（P＜0.05），但濃度過高（1.8 mg/mL）時，酶活力受到顯著抑制（P＜0.05）。當(dāng)灌胃濃度為0.2、0.4 mg/mL 和1 mg/mL 時，腸蛋白酶活力顯著高于對照組（P＜0.05），其中灌胃濃度為0.4 mg/mL 時酶活力達(dá)到最大峰值，但灌胃濃度過高（1.4 mg/mL 和1.8 mg/mL）時，酶活力受到顯著抑制（P＜0.05）。

2.1.2 脂肪酶活力 如圖2 所示，肝脂肪酶活力在?；撬峁辔笣舛葹? mg/mL 時達(dá)到峰值，顯著高于對照組（P＜0.05）；當(dāng)灌胃濃度為0.8 mg/mL 和1.8 mg/mL 時，酶活力受到顯著抑制（P＜0.05）。腸脂肪酶活力在灌胃濃度為0.2～1.4 mg/mL 時，與對照組間無顯著差異（P＞0.05）；當(dāng)灌胃濃度為1.8 mg/mL 時，酶活力受到顯著抑制（P＜0.05）。

圖2 不同濃度?；撬釋χ久富盍Φ挠绊?/p>

2.1.3 淀粉酶活力 如圖3 所示，當(dāng)?；撬峁辔笣舛葹? mg/mL 時，肝淀粉酶活力達(dá)到峰值，顯著高于對照組（P＜0.05）；當(dāng)灌胃濃度為0.4、0.8 、1.8 mg/mL 時，酶活力受到顯著抑制（P＜0.05）。腸淀粉酶活性在灌胃濃度為0.2～1.4 mg/mL 時，各組與對照組間無顯著差異（P＞0.05）；當(dāng)灌胃濃度升至1.8 mg/mL 時，酶活力受到顯著抑制（P＜0.05）。

圖3 不同濃度?；撬釋Φ矸勖富钚缘挠绊?/p>

2.2 ?；撬峁辔负笙富盍﹄S時間的變化趨勢

2.2.1 蛋白酶活力 灌注?；撬岷螅⒓y蛙肝蛋白酶活力在灌后3 h 和7 h 均出現(xiàn)峰值（P＜0.05），卻在灌后1 h 出現(xiàn)最低值（P＜0.05）（圖4）。腸蛋白酶活力在灌后1、3、7 h 出現(xiàn)峰值（P＜0.05），其中最高峰值出現(xiàn)在灌后3 h（圖5）。

圖4 肝蛋白酶活力隨時間的變化趨勢

圖5 腸蛋白酶活力隨時間的變化趨勢

2.2.2 脂肪酶活力 虎紋蛙肝脂肪酶活力在灌注牛磺酸后3 h 和7 h 出現(xiàn)峰值，均顯著高于初始值（P＜0.05），最高峰值出現(xiàn)在灌后3 h（圖6）。腸脂肪酶活力在灌后12 h 內(nèi)出現(xiàn)多次波動，在灌后2、4、7、10 h 出現(xiàn)峰值（P＜0.05）（圖7）。

圖6 肝脂肪酶活力隨時間的變化趨勢

圖7 腸脂肪酶活力隨時間的變化趨勢

2.2.3 淀粉酶活力 虎紋蛙肝淀粉酶活力在灌注?；撬岷? h 和7 h 出現(xiàn)峰值（P＜0.05），最高峰值出現(xiàn)在灌后7 h，卻在灌后1 h 出現(xiàn)最低值（P＜0.05）（圖8）。腸淀粉酶活力在灌后12 h 內(nèi)出現(xiàn)較大波動，但各時間點(diǎn)酶活力值與初始值間均無顯著差異（P＞0.05）（圖9）。

圖8 肝淀粉酶活力隨時間的變化趨勢

圖9 腸淀粉酶活力隨時間的變化趨勢

3 討 論

動物體內(nèi)合成內(nèi)源性牛磺酸需要含硫氨基酸，當(dāng)機(jī)體從外界獲得?；撬岷?，可讓更多的含硫氨基酸參與到蛋白質(zhì)的合成，從而使食物蛋白質(zhì)的質(zhì)量和消化率得到相對提高[5-8]。蛋白酶活性是體現(xiàn)動物對蛋白質(zhì)利用能力的重要指標(biāo)，而?；撬峥梢蕴岣叩鞍酌傅幕盍ΑＳ扔碌萚9]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)灌胃濃度為0.2 mg/mL 時草魚肝胰臟蛋白酶活性最高，而灌胃濃度為0.8 mg/mL 時腸道蛋白酶活性最高，表明肝胰臟蛋白酶活力對?；撬岬姆磻?yīng)要比腸道蛋白酶敏感。該研究同樣采用灌胃方式，發(fā)現(xiàn)當(dāng)?；撬峁辔笣舛葹? mg/mL 時虎紋蛙肝蛋白酶活力達(dá)到峰值，而腸蛋白酶活力在灌胃濃度為0.4 mg/mL 和1 mg/mL 時都會出現(xiàn)峰值，當(dāng)灌胃濃度為0.4 mg/mL 時酶活力達(dá)到最大峰值，說明虎紋蛙腸道蛋白酶活力對?；撬岬姆磻?yīng)要比肝蛋白酶敏感。

?；撬峥梢源龠M(jìn)脂肪和淀粉的分解和利用。?；撬嵩趧游锔闻K內(nèi)與膽酸結(jié)合生成牛磺膽酸，而后者可促進(jìn)脂肪乳化，從而加速脂肪的水解和利用[10]。草魚肝胰臟脂肪酶在灌胃濃度為0.6 mg/mL時活力達(dá)到峰值，而腸道脂肪酶在灌胃濃度為0.8 mg/mL 時達(dá)到峰值[9]。該研究試驗(yàn)結(jié)果表明，泰國虎紋蛙在灌胃濃度為1 mg/mL 時肝脂肪酶活力達(dá)到峰值（P＜0.05），而腸道脂肪酶活力在灌胃濃度為0.2～1.4 mg/mL 時，各處理與對照組的數(shù)值出現(xiàn)波動，但無顯著差異（P＞0.05）。

淀粉酶在酸性條件下會表現(xiàn)出較高的活性，?；撬嵬ㄟ^提高飼料酸度來增強(qiáng)淀粉酶活力。如草魚肝胰臟淀粉酶在?；撬峁辔笣舛葹?.8 mg/mL 時活力可達(dá)到峰值，腸道淀粉酶在灌胃濃度為1 mg/mL 時活力達(dá)到峰值，均著高于對照組[9]。該研究試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)?；撬峁辔笣舛葹? mg/mL 時，泰國虎紋蛙的肝淀粉酶活力達(dá)到峰值；但腸淀粉酶活力在0.2～1.4 mg/mL 范圍內(nèi)與對照均無顯著差異（P＞0.05）。由此可見，腸道的脂肪酶和淀粉酶活力對牛磺酸的劑量反應(yīng)不如肝脂肪酶和淀粉酶活力明顯，說明牛磺酸主要在肝臟中發(fā)揮其生物學(xué)作用。

過量攝入?；撬釙C(jī)體產(chǎn)生條件毒性。高春生等[11]研究表明，在黃河鯉魚的飼料內(nèi)添加1 600 mg/kg 牛磺酸能夠顯著抑制其脂肪酶活力。尤勇等[9]研究表明，飼料內(nèi)?；撬崽砑恿繛? 800 mg/kg 時，可明顯抑制草魚肝胰臟和腸道蛋白酶活性；當(dāng)牛磺酸灌胃濃度達(dá)到1.8 mg/mL 時可顯著降低草魚體內(nèi)蛋白酶活性。在該研究中，當(dāng)灌胃濃度達(dá)到1.8 mg/mL 時能夠顯著抑制泰國虎紋蛙肝臟和腸道組織內(nèi)3 種消化酶的活力（P＜0.05）。

牛磺酸在體內(nèi)對消化酶的持續(xù)作用時間以及不同消化酶對?；撬岬姆磻?yīng)模式均存在物種差異。如草魚僅在灌胃?；撬? h 后肝胰臟和腸道蛋白酶活力出現(xiàn)1 次峰值，而肝胰臟脂肪酶在灌后0～9 h 內(nèi)呈現(xiàn)持續(xù)升高的趨勢[9]。但是，該研究發(fā)現(xiàn)虎紋蛙肝臟組織3 種消化酶活力均在灌后3 h 和7 h達(dá)到峰值（P＜0.05），肝臟和腸道蛋白酶活力在灌后1～10 h 內(nèi)也出現(xiàn)了3～4 次峰值（P＜0.05），且肝蛋白酶和淀粉酶活力在灌后1 h 均出現(xiàn)了顯著下降（P＜0.05）。這種酶活力波動變化的現(xiàn)象與上述草魚的研究結(jié)果存在較大差異。因此，?；撬釋ν茴愊傅恼{(diào)節(jié)可能比魚類更為復(fù)雜，需要進(jìn)一步研究。

總之，適當(dāng)劑量的?；撬釋μ﹪⒓y蛙的消化酶活性具有較為顯著的調(diào)節(jié)作用，其在蛙體內(nèi)對消化酶的持續(xù)作用時間在10 h 左右。然而，攝入量過高（36 mg /kg 體重及以上）會對消化酶活力產(chǎn)生條件毒性。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，推測每日提供20 mg /kg體重的牛磺酸可以顯著提高泰國虎紋蛙的消化酶活力，從而促進(jìn)機(jī)體對飼料營養(yǎng)物質(zhì)的利用效率。

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