Cry1Ab 蛋白在蜘蛛體內的富集及對蜘蛛相關酶活性的影響

周 穎，魏寶陽，王 智，李超民，羅翔宇，肖安琪

（湖南農業(yè)大學生物科學技術學院，湖南 長沙410128）

自1996年，全球第一例轉基因作物在美國開始商品化種植生產以來，轉基因作物就開始大面積推廣，到2011年全世界轉基因作物種植面積由2010年的14 800 萬hm2增加8.1%達到16 000 萬hm2[1]。2009年我國農業(yè)部批準了2 個抗蟲轉基因水稻品系的安全證書后[2-4]，Bt 作物更是得到廣泛的關注。Harwood 等[5]研究表明，轉Bt 基因玉米中的Cry1Ab 蛋白可通過食物鏈的傳遞轉移到玉米地中的相關天敵玉米跳甲、日本金龜子等動物的體內。姜永厚等[6]研究表明，取食轉Bt 水稻的褐飛虱（Nilaparvata lugens）、稻蚜（Sitobion avenae）以及用取食轉Bt 水稻的二化螟或稻眼蝶幼蟲喂食的擬水狼蛛（Pirata subpiraticus）體內都能檢測出Cry1Ab 蛋白，這些研究都表明Bt 蛋白能夠隨著食物鏈進行傳遞。但是，Bt 蛋白隨著食物鏈進行傳遞過程中在蜘蛛體內的富集情況、時間效應以及對蜘蛛體內的相關的酶活性的影響還有待研究。以擬環(huán)紋豹蛛為主要試驗材料，研究了Cry1Ab 蛋白在蜘蛛體內的富集及對蜘蛛相關酶活性的影響，以期為轉Bt 水稻安全性評價提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 供試水稻 轉Cry1Ab 基因水稻汕優(yōu)63（簡稱Bt 水稻）與對照品種親本汕優(yōu)63 均由湖南師范大學提供，Bt 水稻和對照品種在湖南農業(yè)大學實驗室內盆栽進行培養(yǎng)。水稻在生長期內不噴灑任何農藥，其他管理均為常規(guī)管理。

1.1.2 供試稻飛虱 以湖南省農科院水稻所試驗田捕捉的褐飛虱為材料，在實驗室盆栽水稻中進行培養(yǎng)，對照組取食對照水稻，試驗組取食Bt 水稻。

1.1.3 供試蜘蛛 擬環(huán)紋豹蛛采集于湖南農業(yè)科學院水稻所試驗田，采回后分裝于試管內，饑餓48 h 后分別以取食10～15 d 的對照組（即普通汕優(yōu)63水稻）和試驗組（即Bt 水稻）盆栽水稻的褐飛虱進行飼養(yǎng)，提供充足的稻飛虱和水，在溫度25℃、濕度70%的人工氣候箱內進行喂養(yǎng)。喂食褐飛虱5、10、15 d 后的蜘蛛在冰水中用勻漿器進行勻漿后，4 000 r/min 離心，取上清液作為酶源。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計 試驗設2 個處理，蜘蛛饑餓48 h 后，試驗組以取食10～15 d Bt 水稻的褐飛虱飼養(yǎng)，對照組以取食10～15 d 普通汕優(yōu)63 水稻的褐飛虱飼養(yǎng)。試驗期間提供充足的稻飛虱和水，在溫度25℃、濕度70%的人工氣候箱內進行喂養(yǎng)。喂食褐飛虱5、10、15 d 后的蜘蛛在冰水中用勻漿器進行勻漿后，4 000 r/min 離心，取上清液作為酶源。

1.2.2 數據測定 （1）蜘蛛體內可溶性蛋白的測定：可溶性蛋白采用考馬斯亮G-250 法[7]，以牛血清蛋白做蛋白制備標準曲線。（2）酶活力的測定：乙酰膽堿酯酶（AchE）活力測定參照高希武[8]的方法，超氧化物歧化酶（SOD）活力和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力用南京建成公司生產的相關試劑盒進行測定，測定嚴格按照試劑盒說明操作。（3）Bt蛋白含量的測定：Bt蛋白含量測定采用由美國Agdia 公司提供的Bt-Cry1Ab/Ac ELISA 平板試劑盒測定。

1.2.3 數據分析 所有數據均用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析，用Excel 2003 作圖。

2 結果與分析

2.1 稻飛虱和蜘蛛體內Cry1Ab 蛋白含量的變化

由表1 可知，取食Bt 水稻后，在0～5 d 內，褐飛虱體內的Bt 蛋白含量很低，幾乎沒有檢測到，在5～15 d 內，褐飛虱體內的Bt蛋白含量逐漸上升，在第15 天時到達最高。故研究采用取食Bt 水稻10～15 d 內的褐飛虱喂食蜘蛛。

表1 褐飛虱、擬環(huán)紋豹蛛體內Cry1Ab 蛋白含量

喂食取食Bt蛋白10 d 的稻飛虱后，在5～15 d內，蜘蛛體內均檢測到Bt蛋白含量，在第10 天Bt蛋白含量達到最高，10 d 后呈逐漸下降趨勢，但在第15 天時，蜘蛛體內的Bt 蛋白含量仍高于第5 天時的水平。蜘蛛體內Bt蛋白的最高含量高于稻飛虱體內Bt蛋白的最高含量，說明Bt蛋白沿“Bt 水稻—稻飛虱—蜘蛛”這一條食物鏈傳遞時具有生物富集效應。

2.2 蜘蛛體內相關酶活力的變化

2.2.1 AchE 活力的變化 如表2 所示，在喂食含有Bt蛋白的稻飛虱5 d 后，試驗組擬環(huán)紋豹蛛體內的AchE 活力較對照組的出現了略微升高；在喂食10 d 后，當擬環(huán)紋豹蛛體內的Bt蛋白含量達到最高值時，試驗組擬環(huán)紋豹蛛體內的AchE 低于對照組；在喂食15 d 時，試驗組擬環(huán)紋豹蛛體內的AchE 活力高于對照組，但沒有達到顯著性差異（P>0.05）。由此推測，AchE 活力的變化可能與Bt蛋白的含量存在負相關性。

表2 Cry1Ab 蛋白富集作用對擬環(huán)紋豹蛛體內酶活力的影響 （U/mg）

2.2.2 SOD 活力的變化 如表2 所示，在喂食含有Bt 蛋白的褐飛虱5 d 后，試驗組擬環(huán)紋豹蛛體內的SOD 活力較對照組的略低，可能是Bt蛋白的富集對蜘蛛體內的酶活力出現了抑制作用；在喂食10 d 后，擬環(huán)紋豹蛛體內的Bt蛋白含量處于最高值，試驗組擬環(huán)紋豹蛛體內的SOD 活力高于對照組，由于Bt蛋白的富集，造成蜘蛛體內自由基含量較多，SOD 對其進行消除；在喂食15 d 時，試驗組擬環(huán)紋豹蛛體內的SOD 活力均低于對照組，可能是由于Bt蛋白的富集造成整個擬環(huán)紋豹蛛體內的SOD 活性無法調控，從而抑制酶活力。但是，在整個試驗期間試驗組的擬環(huán)紋豹蛛體內的SOD 活力與對照組相比，均沒有達到顯著性差異（P>0.05）。

2.2.3 GSH-Px 活力的變化 如表2 所示，在喂食含有Bt蛋白的稻飛虱5 d 后，試驗組擬環(huán)紋豹蛛體內的GSH-Px 活力略高于對照組；但在喂食10 d后，擬環(huán)紋豹蛛體內的Bt蛋白含量達到最高值時，試驗組擬環(huán)紋豹蛛體內的GSH-Px 活力低于對照組，且存在極顯著性差異（P<0.01）。這可能是由于蜘蛛體內的保護機制開始能夠消除Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛體內酶活力的影響，但由于Bt蛋白的大量富集，超出了保護機制的范圍，導致酶活力受到抑制。在喂食15 d 后，試驗組擬環(huán)紋豹蛛體內的GSH-Px活力仍然低于對照組，說明GSH-Px 活力的恢復需要一定的時間。由此推測，GSH-Px 活力的變化可能與Bt 蛋白的含量存在負相關性。

3 討 論

該研究中Bt 蛋白能夠隨著“Bt 水稻—稻飛虱—蜘蛛（擬環(huán)紋豹蛛）”食物鏈進行傳遞，并具有生物放大效應；擬環(huán)紋豹蛛體內的Bt 蛋白含量隨著時間變化而變化，當Bt 蛋白增長到一定的程度后，逐漸出現下降的趨勢，這和陳茂等[9]研究結果一致，可能與蜘蛛體內存在相關保護機制有關，其具體機理還有待進一步研究。

Bt 蛋白在蜘蛛體內的富集造成蜘蛛體內相關酶活力的變化。喂食5 d 時，Bt 蛋白含量開始在體內積累，蜘蛛體內相關的保護酶，主要是GSH-Px活力升高，來抵御Bt 蛋白的影響，同時蜘蛛體內的AchE 活力也升高，通過在神經方面的某些調控作用來對Bt 蛋白活力起到防御作用；而SOD 活力下降，可能是由于Bt蛋白對其產生抑制作用所致。隨著Bt 蛋白的持續(xù)積累，在喂食10 d 后，蜘蛛體內的AchE 和GSH-Px 活力出現最低值，其中GSHPx 活力與對照組差異達極顯著水平，可能是因為Bt 蛋白的持續(xù)作用超出酶活力能夠調控的范圍，使酶活力反而受到抑制；而SOD 活力在此時升高，可能是由于大量Bt 蛋白積累，激活了其體內防御機制所致。之后，蜘蛛體內的防御機制導致Bt 蛋白含量下降，GSH-Px 和AchE 活力開始不斷恢復，在喂食15 d 時均還略高于對照組。

在該研究中，酶活力的變化情況和張志罡等[10]報道的Cry1Ab 蛋白對稻縱卷葉螟幼蟲體內AchE活力先迅速上升后有劇烈下降趨勢，以及SOD 先穩(wěn)定平緩后急劇升高又迅速下降趨勢不一致；和郭文娟等[11]報道的基因水稻對大螟幼蟲體內3 種保護酶的變化情況以及張雁等[12]報道的轉Bt 基因南林895 楊對楊扇舟蛾體內酶的變化情況均不相同，這可能是由于Bt 蛋白對靶標生物和非靶標生物的作用機理不一致所造成的。

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