不同因素對灰毛豆樹皮中12α-羥基魚藤酮的含量影響研究

莫 娟，鄒 凱，肖志翔，李冠華，丁文兵，李有志

（(1.湖南農業(yè)大學植物保護學院，湖南 長沙410128；2.邵陽縣煙草公司，湖南 邵陽422100；3.湖南省農業(yè)廳，湖南 長沙410005）

灰毛豆（Tephrosia purpurea）為豆科灰毛豆屬 植物，又名野青樹等。該植物主要分布于東南亞等國和中國的福建、海南、廣東、廣西、云南、湖南等地。在巴基斯坦，該植物是一種傳統(tǒng)草藥植物，常作為利尿劑和通便劑使用[1]。國外曾從醫(yī)用的角度研究了該植物地上部分乙醇提取物對老鼠免疫功能的影響[2]，并從灰毛豆種子和根中分離出幾個黃酮類化合物[3-4]；李有志等[5]曾報道該植物甲醇提取物對多種害蟲具有毒殺活性，并分離鑒定了該植物樹皮中的主要殺蟲成分[6]。此后，李冠華等[7-8]又進一步研究了該植物種子甲醇提取物對白背飛虱和谷蠹的毒殺活性，并報道該植物種子中的殺蟲成分及其殺蟲活性[9]。湖南農業(yè)大學昆蟲研究所已利用該植物中主要殺蟲成分開發(fā)植物源殺蟲劑10%12α-羥基魚藤酮EC，現(xiàn)已大面積推廣使用[10]。試驗研究了灰毛豆不同品種樹皮中12α-羥基魚藤酮的含量、含量與生長期的關系以及不同生態(tài)條件和施肥措施對灰毛豆樹皮中該化合物含量的影響，以期為該殺蟲植物的開發(fā)利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料與儀器

從海南、廣西、廣東、湖南和江西等地采集16個野生灰毛豆品種的種子。試驗中所用肥料尿素、硫酸鉀和磷酸氫鈣均從試驗點附近農資市場上購買。液相色譜串聯(lián)四級桿質譜聯(lián)用儀（Triple Quad LC/MS/MS，美國Agilent公司，6410B）；ZORBAX SB-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8μm，美國Agilent公司）；Eclipse XDB C18（4.6 mm×150 mm，5.0 μm，美國Agilent公司）和ZORBAX Extend-C18（2.1 mm×100 mm，3.5μm，美國Agilent公司）；氮吹儀（Organomation Associate）；十二孔固相萃取裝置（美國Supelco公司）；佛羅里硅土（Florisil）固相萃取柱（1 g/6mL）（美國Sepax公司）。

1.2 試驗方法

（1）12α-羥基魚藤酮含量的檢測。提取方法同相關文獻[5-6]，12α-羥基魚藤酮含量檢測采用王蘇寧[11]建立的液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測。

（2）灰毛豆不同品種樹皮中12-a羥基魚藤酮含量的檢測。在2011年1月初分別在廣東、廣西、湖南、江西等16個野生灰毛豆品種采集地播種，待其苗出土后用標簽標記播種時間，分別于2011年和2012年的11月中旬采集該植物樹皮，陰干、粉碎后供12α-羥基魚藤酮含量檢測。其提取、檢測方法見（1）。

（3）不同樹齡灰毛豆樹皮中12α-羥基魚藤酮含量的檢測。在湖南省江華縣大石橋鄉(xiāng)種植收集的16個野生灰毛豆品種（圖1），于2011年1月初播種，僅保留出苗時間在2011年1月10日至2011年1月15日間的樹苗，并用標簽標明每棵樹苗的出苗時間及品種名稱。從樹苗苗齡8個月開始于每月的25日收集不同品種的樹皮，將其陰干后供檢測樹皮中12α-羥基魚藤酮的含量。其提取、檢測方法同（1）。

（4）施用不同肥料對灰毛豆中12α-羥基魚藤酮含量及產量的影響?；颐狗N植地點為湖南省江華縣大石橋鄉(xiāng)，土地為當地多年種植水稻的稻田，灰毛豆選擇地方品種廣西2號。試驗設4個處理，即尿素5 kg/667m2、硫酸鉀5 kg/667m2、磷酸氫鈣20 kg/667m2和空白對照（完全不使用前述3種肥料），采用完全隨機區(qū)組排列，重復4次。每小區(qū)面積25 m2，小區(qū)間挖25 cm深的排水溝，所用肥料在平整土地時作為基肥使用。2012年1月17日播種，待灰毛豆樹苗株高約20 cm后間苗，保留有效苗數量為20株/m2，分布較均勻，2012年11月9日采收灰毛豆樹苗地上部分枝條（離地面約3cm處砍斷），分別收集各小區(qū)灰毛豆地上部分并將其陰干，除掉葉片后稱重，分別統(tǒng)計不同小區(qū)灰毛豆地上部分莖干枝條的生物量（干重）。按方法（1）粉碎、提取、檢測提取物中的12α-羥基魚藤酮，計算不同處理中12α-羥基魚藤酮的產量。

（5）數據統(tǒng)計分析。利用DPS數據處理系統(tǒng)[12]軟件（Version 9.5）進行統(tǒng)計，統(tǒng)計分析中百分比數據經反正弦平方根轉換，均值差異顯著性通過Duncan’s新復極差法進行多重分析比較。

2 結果與分析

2.1 不同品種灰毛豆樹皮中12-a羥基魚藤酮的含量

從表1中看出，一年樹齡的灰毛豆樹皮中12α-羥基魚藤酮含量在0.22%～5.95%之間，不同品種灰毛豆樹皮中該化合物含量差異顯著（P<0.05），含量最高的是廣西2號（5.95%），其次是海南1號（3.09%）；兩年樹齡的灰毛豆樹皮中該化合物含量在0.23%～6.01%之間，含量最高的仍然是廣西2號（6.01%），其次是海南1號（3.16%）。這表明，不同品種樹皮中12α-羥基魚藤酮的含量差異較大。

2.2 不同樹齡灰毛豆樹皮中12α-羥基魚藤酮的含量

16個灰毛豆地方品種不同樹齡樹皮中12α-羥基魚藤酮的含量變化如圖1。這些品種樹皮中12α-羥基魚藤酮的含量呈現(xiàn)相同的規(guī)律，當樹齡11月內時，樹皮中12α-羥基魚藤酮的含量逐漸升高，在11月樹齡樹皮中12α-羥基魚藤酮的含量接近最高值，此后樹皮中該化合物的含量基本穩(wěn)定。在這16個地方品種中，廣西2號中的12α-羥基魚藤酮的含量最高，其次是廣西3號。進一步的方差分析結果表明，廣西2號樹皮中該化合物的含量遠高于其它地方品種樹皮中的含量（P<0.01）。

表1 灰毛豆不同品種樹皮中12α-羥基魚藤酮的含量（%）

圖1 16個灰毛豆品種不同樹齡樹皮中12α-羥基魚藤酮的含量

2.3 不同肥料對灰毛豆樹皮中12α-羥基魚藤酮含量及產量的影響

從不同處理對灰毛豆地上部分的生物量來看，施用不同肥料對灰毛豆地上部分生物量有顯著的影響（表2），3個處理的生物量均顯著高于對照（P<0.05），其中施用肥料磷酸氫鈣后的地上部分生物量最高。由此可見，施用這3種肥料均可提高該植物地上部分的生物量。從施用不同肥料對該植物樹皮中12α-羥基魚藤酮含量的影響來看，施用磷酸氫鈣后樹皮中12α-羥基魚藤酮的含量顯著高于另外兩個處理和對照組中該化合物的含量，而施用尿素和硫酸鉀后，樹皮中該化合物的含量和對照組中的含量差異不顯著（P＞0.05），可見施用磷酸氫鈣能顯著提高該植物樹皮中12α-羥基魚藤酮的含量。從施用不同肥料對12α-羥基魚藤酮產量的影響來看，不同處理間12α-羥基魚藤酮的產量差異顯著，3個肥料處理中12α-羥基魚藤酮的產量均顯著高于空白對照組中該化合物的含量（P<0.05）。施用磷酸氫鈣、尿素和硫酸鉀處理后，該化合 物 的 產 量 依 次 是75.33、66.34、64.26 kg/667m2（表2），可見這3種肥料均能顯著提高12α-羥基魚藤酮的產量，其中提高幅度最大的是磷酸氫鈣。

表2 不同施肥處理對灰毛豆樹皮中12α-羥基魚藤酮含量及產量的影響

3 結論與討論

3.1 小結

不同品種樹皮中12α-羥基魚藤酮的含量差異較大，廣西2號品種是一種適宜在湖南江華推廣種植的殺蟲資源植物，其最佳采收時期為11月；施用磷酸氫鈣有利于提高該植物中12α-羥基魚藤酮的含量和產量。

3.2 討論

（1）適宜推廣種植的灰毛豆品種及最佳采收期。植物中次生代謝產物含量除與該植物遺傳基礎有關外，通常還受生長地生態(tài)條件和采集時間的影響，不同地點采集的同種植物中各化合物的含量可能不同[13]。16個灰毛豆品種樹皮中12α-羥基魚藤酮的含量不同，這表明不同品種的遺傳基礎確實存在差異。研究結果還表明，灰毛豆樹皮中12α-羥基魚藤酮的含量也與生長地的生態(tài)條件有關，如品種海南1號種植在江華和原產地海南時，樹齡為11個月時樹皮中該化合物的含量分別是2.03%和3.09%，兩者間差異顯著（t測驗，P<0.05）。這表明，在開發(fā)利用殺蟲植物灰毛豆時，應先試種，確定最佳品種后方可大規(guī)模種植。

廣西2號不論是在原產地海南，還是在被引種到湖南江華種植，樹皮中該化合物的含量均顯著高于其他品種樹皮中的含量?？梢?，從開發(fā)利用該植物樹皮中12α-羥基魚藤酮的角度而言，廣西2號是一種適宜在湖南江華推廣種植的灰毛豆品種。

灰毛豆樹皮中12α-羥基魚藤酮的含量與灰毛豆的樹齡密切相關，當樹齡在11個月以前，樹皮中該化合物的含量升高較快；在11個月后，樹皮中該化合物的含量趨于穩(wěn)定。根據試驗結果，湖南江華1月人工種植灰毛豆的最佳采集時間為11月，此時該植物樹皮中的12α-羥基魚藤酮的含量已趨向穩(wěn)定，接近最高值。

（2）栽培措施對灰毛豆樹皮中12α-羥基魚藤酮含量及產量的影響。原材料供應不足以及植物材料中活性成分含量低等，是當前制約植物源殺蟲劑產業(yè)化的重要因素之一。人工種植殺蟲植物是緩解原材料供應不足的主動措施，是獲得優(yōu)質原材料的重要途徑。在人工種植過程中如何通過栽培管理措施調控目標產物向高產方向發(fā)展，是灰毛豆栽培過程中值得研究的問題。研究結果表明，盡管灰毛豆樹皮中12α-羥基魚藤酮的含量受其遺傳基礎決定，但通過施肥措施可提高該化合物的產量，施用磷酸氫鈣可以提高該植物地上部分的生物量，更重要的是可顯著提高樹皮中12α-羥基魚藤酮的含量，大幅度地提高該化合物的產量，這對開發(fā)12α-羥基魚藤酮植物源殺蟲劑來說具有重要意義。迄今為止，尚無通過施肥措施提高該植物中代謝產物的研究報道，有關施用磷酸氫鈣提高12α-羥基魚藤酮含量的機制尚不清楚，有待進一步研究。為促進利用該植物開發(fā)植物源殺蟲劑12α-羥基魚藤酮，探討如何通過合理密植、加強肥水管理來提高該植物中12α-羥基魚藤酮的產量，規(guī)范灰毛豆的人工栽培措施是值得進一步研究的問題。

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