番茄紅素抗氧化應(yīng)激效應(yīng)對(duì)大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響①

李曉，羅晨禹，楊拯，謝少華，張堯，楊海燕，馬延仃，張藝，胡雯思，卓睿，李亞光

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病，致殘率和死亡率都很高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年大約新增30萬(wàn)脊髓損傷患者。因此，我們必須開(kāi)展基礎(chǔ)研究，以期為脊髓損傷的臨床治療提供新思路和新方法。脊髓損傷的主要病理改變包括由原發(fā)性損傷導(dǎo)致出血、缺血和缺氧等引起的一系列繼發(fā)性損傷，如Ca2+聚集、興奮性氨基酸的釋放、大量自由基產(chǎn)生、脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等[1-3]。而這些繼發(fā)性損害是加重脊髓神經(jīng)功能喪失的關(guān)鍵因素。因此，在脊髓損傷早期，有效地控制脊髓的繼發(fā)性損傷是一個(gè)重要的研究方向。

研究表明，氧化應(yīng)激效應(yīng)在脊髓損傷的病理改變中發(fā)揮重要作用，與脊髓損傷時(shí)脊髓及脊髓所支配區(qū)域的損傷有密切的聯(lián)系[4]。番茄紅素(lycopene,LP)是一種開(kāi)鏈?zhǔn)降牟伙柡皖?lèi)胡蘿卜素，屬于天然脂溶性色素，它具有極強(qiáng)的抗氧化和清除自由基的能力，其抗氧化性能在天然類(lèi)胡蘿卜素中最強(qiáng)[5-6]。

本實(shí)驗(yàn)采用測(cè)定脊髓損傷模型血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)的方法，探討番茄紅素對(duì)脊髓損傷后大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康、清潔級(jí)成年Sprague-Dawley大鼠36只，雌性(雌性大鼠尿道短，尿道感染、水腫發(fā)生概率低，不易形成尿道阻塞，有利于脊髓損傷術(shù)后護(hù)理，可提高術(shù)后大鼠生存率)，體重(230±20)g，由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(川)-10-2006。將36只大鼠按Allen法造脊髓損傷模型后隨機(jī)分為3組：對(duì)照組(A組)、甲潑尼龍琥珀酸鈉治療組(B組)和番茄紅素治療組(C組)，每組12只。每組再隨機(jī)按1 d、3 d、7 d分成3個(gè)亞組，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)4只。

1.2 主要試劑和儀器

6%番茄紅素油樹(shù)脂(新疆瑞德萊福生物科技有限公司)，批號(hào)：HY1007261；注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉(天津藥業(yè)焦作有限公司)，批號(hào)：10031501；戊巴比妥鈉(德國(guó)進(jìn)口分裝，北京化學(xué)試劑公司)，批號(hào)：100808；注射用青霉素鈉(瑞陽(yáng)制藥有限公司)，批號(hào)：10013101；氯化鈉注射液(安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司)，批號(hào)：110120 2E；丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，批號(hào)：20111217。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，批號(hào)：20111217；自制數(shù)字式脊髓損傷動(dòng)物模型制備儀；TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；721E型可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)。

1.3 模型制備

選取正常Sprague-Dawley大鼠，用1.5%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，俯臥位固定，背部去毛，常規(guī)消毒鋪巾。以T9棘突為中心做背部正中切口，長(zhǎng)約2 cm，然后用手術(shù)刀緊靠棘突兩邊切開(kāi)背部肌肉，明確T9的位置，接著小心去除T9椎骨上的肌肉。之后進(jìn)行椎板切除術(shù)，先用有齒鑷剝離T9棘突和椎間軟組織，再用無(wú)齒鑷小心剝開(kāi)錐板，并適當(dāng)修剪兩側(cè)錐板，充分暴露脊髓，用自制數(shù)字式脊髓損傷動(dòng)物模型制備儀打擊器制成脊髓損傷模型，打擊強(qiáng)度為10 g×25 mm，打擊后即刻見(jiàn)鼠尾痙攣性擺動(dòng)，雙后肢及軀體發(fā)生不同程度抽搐，隨后完全松弛，標(biāo)志模型制備成功，之后逐層縫合切口。由于手術(shù)過(guò)程中有一定出血而使大鼠血容量減少，術(shù)后立即以9 ml/kg腹腔注射氯化鈉注射液，并腹腔注射青霉素以防感染，待動(dòng)物清醒后放回飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng)。術(shù)后大鼠自由飲水、進(jìn)食，保持適宜室溫和濕度，定時(shí)清潔籠具，并保持大鼠身體干燥，每天擠壓膀胱排尿3次，直至恢復(fù)自主排尿；術(shù)后連續(xù)3 d每天腹腔注射青霉素8×104U。

1.4 治療方法

A組：造模成功后不給予任何藥物治療。B組：造模成功后30 min按首次劑量30 mg/kg腹腔注射甲潑尼龍琥珀酸鈉，此后按5.4 mg/kg?h每6小時(shí)注射1次，共4次。C組：造模成功后30 min灌胃溶有番茄紅素油樹(shù)脂的色拉油2 ml(按20 mg/kg番茄紅素配制)[7]，此后每天灌胃1次。

1.5 評(píng)定方法

每組大鼠按1 d、3 d和7 d亞組進(jìn)行評(píng)定，內(nèi)容如下。

1.5.1 斜板試驗(yàn)[8]將大鼠置于自制墊有橡膠墊的斜板上，使大鼠身體縱軸與斜板縱軸平行，頭朝斜板抬高側(cè)，斜板傾斜角度從0°開(kāi)始緩慢上升。記錄大鼠停留在斜板上維持至少5 s時(shí)的最大角度，每次測(cè)試3遍，取其平均值。采用雙人雙盲法，每次評(píng)分由熟悉評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)但與實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)的人員完成。

1.5.2 BBB評(píng)分[9]將大鼠排空膀胱后置于寬大活動(dòng)場(chǎng)地，采用雙人雙盲法觀察其后肢運(yùn)動(dòng)情況，聯(lián)合考察大鼠后肢各關(guān)節(jié)活動(dòng)、后肢的步態(tài)和協(xié)調(diào)功能、運(yùn)動(dòng)時(shí)爪子的精細(xì)運(yùn)動(dòng)。取左右兩側(cè)肢體評(píng)分平均值，作為最后得分。

1.5.3 血清中SOD和MDA測(cè)定 大鼠均于行為測(cè)試完成后，戊巴比妥鈉麻醉，經(jīng)右心室取血3 ml，立即3000 r/min離心15 min，取上清液，存于-20℃冰箱。SOD和MDA分別采用黃嘌呤氧化法和硫代巴比妥酸檢測(cè)，操作方法按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況

大鼠術(shù)后蘇醒，靜臥少動(dòng)，氣息較微，雙后肢運(yùn)動(dòng)功能喪失，肌張力降為零，無(wú)食欲，不進(jìn)水，尿失禁或下腹部膨隆，發(fā)生尿潴留，呈現(xiàn)不完全性脊髓損傷的表現(xiàn)。術(shù)后前3 d，大鼠活動(dòng)、進(jìn)食較少，尿潴留比較嚴(yán)重，部分伴血尿及腹部脹氣，此后飲食逐漸增加，活動(dòng)逐漸增多。由于實(shí)驗(yàn)期間護(hù)理良好，5~7 d后，所有大鼠能夠基本恢復(fù)自主排尿，且傷口未見(jiàn)感染，身體未出現(xiàn)壓瘡，36只大鼠均進(jìn)入結(jié)果分析。

2.2 斜板試驗(yàn)

術(shù)后1 d、3 d，C組斜板試驗(yàn)評(píng)分均高于A組(P<0.05)，7 d無(wú)顯著性差異(P>0.05)。術(shù)后1 d、3 d、7 d，B組斜板試驗(yàn)評(píng)分均高于A組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 脊髓損傷大鼠斜板評(píng)分結(jié)果

2.3 BBB評(píng)分

術(shù)前所有大鼠評(píng)分均為21分。術(shù)后1 d、3 d、7 d，C組與A組相比，BBB評(píng)分均增高(P<0.05)，B組術(shù)后1 d、7 d評(píng)分明顯高于A組(P<0.01)，3 d雖也高于A組，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 脊髓損傷大鼠BBB評(píng)分結(jié)果

2.4 SOD

術(shù)后1 d、3 d、7 d，C組與A組相比，SOD活性升高(P<0.05)。術(shù)后1 d，B組SOD活性與A組無(wú)顯著性差異(P>0.05)；術(shù)后3 d、7 d，B組SOD活性升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 脊髓損傷大鼠SOD活性測(cè)試結(jié)果(U/ml)

2.5 MDA

術(shù)后1 d，B組MDA含量較A組降低(P<0.05)，C組與A組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。術(shù)后3 d，C組MDA含量低于A組(P<0.05)，但B組與A組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。術(shù)后7 d，C組、B組MDA含量均顯著低于A組(P<0.001)。見(jiàn)表4。

表4 脊髓損傷大鼠MDA含量測(cè)定結(jié)果(nmol/ml)

3 討論

番茄紅素是一種開(kāi)鏈?zhǔn)讲伙柡皖?lèi)胡蘿卜素，主要存在于番茄、西瓜、葡萄、柚、木瓜、石榴、秋橄欖等植物中，動(dòng)物機(jī)體自身不能合成，只能從食物中攝取。作為一種功能性色素，番茄紅素具有多種生物學(xué)效應(yīng)，其中抗氧化作用受到廣泛關(guān)注。

研究表明，番茄紅素的抗氧化性能是天然類(lèi)胡蘿卜素中最強(qiáng)的，抗氧化能力是β-胡蘿卜素的2倍，維生素E的100倍[10]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，番茄紅素能提高大鼠超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱苷肽過(guò)氧化物酶以及谷胱苷肽還原酶的活性，從而提高其抗氧化能力，降低對(duì)毒物的敏感性[11]。有報(bào)道顯示，番茄紅素通過(guò)其高效猝滅單線氧態(tài)和清除自由基的能力，抑制活性氧(ROS)的產(chǎn)生，有效地減少顆粒物對(duì)細(xì)胞DNA的損傷[12]。Rao等發(fā)現(xiàn)食用番茄紅素2周后可顯著降低體內(nèi)蛋白、脂類(lèi)和脂蛋白的氧化損傷[6]。Porrini等的實(shí)驗(yàn)表明，在給一組成年女性補(bǔ)充番茄紅素后，淋巴細(xì)胞抗氧化應(yīng)激效應(yīng)能力顯著增強(qiáng)[13]。因此多食用富含番茄紅素的食品對(duì)保持人體健康很有益處。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，番茄紅素還可以對(duì)抗大鼠缺血再灌注腦組織損傷、動(dòng)脈粥樣硬化、大鼠急性肺損傷、H2O2誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞損傷、小鼠肝纖維化、癌細(xì)胞增殖等。這些都與番茄紅素的抗氧化和清除自由基的能力有關(guān)。綜上所述，番茄紅素可以通過(guò)其高效猝滅單線氧態(tài)和清除自由基的能力，抑制活性氧的產(chǎn)生，清除自由基，減少脂質(zhì)的過(guò)氧化，減輕細(xì)胞的氧化程度來(lái)直接保護(hù)細(xì)胞。

眾所周知，脊髓損傷后的治療仍為世界醫(yī)學(xué)界的難題。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)脊髓損傷的損傷機(jī)制進(jìn)行了廣泛的探討和研究，認(rèn)識(shí)到脊髓損傷在原發(fā)損傷的基礎(chǔ)上發(fā)展一系列的進(jìn)行性病理改變，而這種繼發(fā)性的病理改變將加重脊髓損傷，甚至造成脊髓的不可逆?zhèn)14]。大量研究顯示，脊髓損傷后氧化應(yīng)激反應(yīng)是引起脊髓組織繼發(fā)性損傷的主要因素之一[15]。因?yàn)榧顾钃p傷后產(chǎn)生并釋放大量的氧自由基[16]，而脊髓神經(jīng)元細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中含有豐富的脂質(zhì)，所產(chǎn)生的氧自由基性質(zhì)極不穩(wěn)定，能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，破壞膜結(jié)構(gòu)的通透性與完整性，導(dǎo)致細(xì)胞變性壞死。SOD是細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化酶和自由基清除劑，能保護(hù)細(xì)胞對(duì)抗氧自由基的侵害，其水平的高低，反映出內(nèi)源性氧自由基清除系統(tǒng)功能的強(qiáng)弱[17]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，測(cè)定MDA含量可直接反映體內(nèi)氧自由基生成水平，其含量高低是組織細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志[18]。因此，通過(guò)MDA含量和SOD活性的測(cè)定可以間接反映體內(nèi)抗氧化應(yīng)激效應(yīng)的能力。

本研究結(jié)果顯示，番茄紅素能顯著提高脊髓損傷模型血清中SOD水平，抑制MDA產(chǎn)生，有效對(duì)抗氧自由基介導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，減輕脊髓損傷后自由基對(duì)脊髓血管及神經(jīng)細(xì)胞等的繼發(fā)損傷，發(fā)揮其對(duì)脊髓損傷保護(hù)和治療作用，從而有效促進(jìn)脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)為番茄紅素臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，但它對(duì)脊髓損傷的治療效果是否呈劑量依賴尚不清楚。有報(bào)道顯示，在高濃度下，番茄紅素清除自由基的能力喪失，推測(cè)是由高濃度時(shí)形成更多的番茄紅素過(guò)氧化基團(tuán)以及番茄紅素自氧化速度加快造成[19]。因此，探索番茄紅素治療脊髓損傷的最佳劑量，還需更全面和深入的研究。

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