枯草芽孢桿菌胞外酶對于玉米粉的修飾改性研究

李姝睿，牛春華，劉新鳳，李 達，周宏璐，王景會*

(吉林省農業(yè)科學院，吉林 長春 130033)

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是美國食品及藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）及我國衛(wèi)生部都認定的安全菌種，更是當今工業(yè)酶的主要生產菌種之一[1]，主要用于生產淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶[2]。尤其近年來的研究表明，其分泌的生物酶在玉米的生物改性中將發(fā)揮越來越重要的作用[3]。

淀粉及蛋白質是玉米粉的主要成分，蛋白質中氨基酸組成的變化及淀粉中直鏈淀粉與支鏈淀粉的數(shù)量、比例等都對玉米粉的食用及加工品質有重要影響[4]。實驗主要研究了枯草芽孢桿菌胞外酶修飾改性前后玉米粉顆粒形態(tài)、結晶類型、淀粉及氨基酸的變化，以便于進一步探討枯草芽孢桿菌胞外酶對于玉米粉修飾改性的原因及作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米粉：普通黃色凹齒玉米粉，吉林省農業(yè)科學院農產品加工研究所提供。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）：吉林省農業(yè)科學院食品生物技術實驗室分離鑒定并保存。

蛋白胨、酵母浸粉：北京奧博星生物技術有限責任公司；3，5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）試劑：北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；氯化鈉：北京化工廠；鹽酸：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

HZQ-X100全溫振蕩培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；Evolution RC高速冷凍離心機：美國Thermo Stovall公司；WYT-32型手持式糖度計：泉州光學儀器廠；Varian Cary 300紫外可見分光光度計：澳大利亞PTY電器有限公司；JJ200電子天平：美國雙杰公司；DHC-9023A電熱鼓風干燥箱：上海一恒科技有限公司；S-433D型全自動氨基酸分析儀：德國Sykam公司；JSM-6700F掃描電鏡：日本Sanyo公司；XRD X-射線衍射儀：日本Rigaku Radiation Shield公司。

1.3 方法

1.3.1 枯草芽孢桿菌胞外酶對玉米粉的修飾改性

取在（Luria-Bertani，LB）瓊脂平板上活化的枯草芽孢桿菌，接入LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220r/min振蕩培養(yǎng)20h后離心，上清即為胞外粗酶液。然后，在上清液中加入10%的玉米粉（w/v）振蕩處理10h取出，4℃、8000r/min離心10min，去上清，沉淀于45℃烘干粉碎，過100目篩待用。

1.3.2 生物酶修飾對于玉米淀粉顆粒形態(tài)的影響

將待測玉米粉樣品均勻分布在粘有導電雙面膠的樣品臺面上，真空條件下噴上一層鉑金，然后固定于載物臺上，在掃描電鏡上觀察淀粉顆粒的形態(tài)。

1.3.3玉米淀粉顆粒的X-射線衍射分析

采用粉末衍射法測定，分析測試條件設定為：特征射線CuKα，管流40mA，管壓40kV，掃描速度12°/min，掃描范圍2θ＝0°～80°。

1.3.4 淀粉，直鏈淀粉，支鏈淀粉含量的測定

準確稱取玉米粉樣品0.1000g，加入10mL0.5mol/LKOH，將上述燒杯置于60℃水浴中保溫10min，并充分攪拌，然后用蒸餾水定容至50mL，搖勻，靜置20min。取2.5mL上清，加入蒸餾水30mL，用0.1mol/L HCl將溶液pH值調至3.5，然后加入0.5mL碘試劑，最后用蒸餾水定容至刻50mL，靜置30min，分別測定其吸光度值。

1.3.5 可溶性糖的測定

采用蒽酮法測定[5]。

1.3.6 還原糖的測定

采用3，5-二硝基水楊酸法測定[6]。

1.3.7 糊精的測定

準確稱取玉米粉樣品0.5g，加入5mL蒸餾水，攪拌均勻。50℃恒溫水浴中保溫20min，確保還原糖充分浸出，4℃、5000r/min離心10min，取1mL上清液，緩慢加入8mL 95%vol的乙醇，室溫放置16h以上促使糊精沉淀。4℃、5000r/min離心8min，棄上清，沉淀加入蒸餾水10mL并攪拌均勻，然后加入1mL濃鹽酸，121℃高壓蒸煮30min，促使糊精基本上都水解為葡萄糖。冷卻至室溫后，用20%NaOH溶液中和，定容至15mL，然后依照上述還原糖的測定方法測定葡萄糖含量。

1.3.8 玉米粉中氨基酸的測定

參照參考文獻[7]中飼料氨基酸的測定方法進行。

2 結果與分析

2.1 玉米淀粉顆粒的電鏡觀察

淀粉顆粒的大小、形狀與其來源密切相關[8]，也影響著淀粉的功能。如小顆粒淀粉由于具有較大的表面積，消化速率就要快于大顆粒淀粉[9]。有研究發(fā)現(xiàn)[10]，破碎對于谷物淀粉顆粒的破壞程度極低，不足0.5%。圖1為生物酶修飾前后玉米淀粉顆粒形態(tài)的電鏡照片，可以看到玉米淀粉顆粒呈多邊形，表面光滑。經過枯草芽孢桿菌胞外酶修飾后，淀粉顆粒表面形成明顯酶作用后的孔洞，顆粒整體絕大部分依然保持完整，說明酶的修飾并沒有引起淀粉顆粒崩潰，而是破壞玉米粉顆粒的表面結構，然后滲入淀粉顆粒內部[11]，通過改變淀粉的分子結構，分子取向等發(fā)生作用，進而改變玉米粉的品質[12-13]。

2.2 生物酶修飾改性玉米粉的X-射線衍射測定

X-射線是一種波長很短（約為（20～0.06）×10-8cm）的電磁波，當X-射線與物質相遇時，會產生一系列的效應，任何一種結晶的固體化合物由于該物質的內部結構特點的不同，都能夠得到一套衍射峰位置及衍射強度完全不同的特征X-射線衍射圖，這些衍射數(shù)據(jù)提供了該晶體許多的信息，如物相的定量、定性分析，晶體粒度大小和晶格的畸變等。目前，X-射線衍射分析已經成為研究晶體最方便、最重要的手段[14]。實驗結果見圖2。原玉米粉對照及各種微生物胞外酶修飾的玉米粉，基本都是在15°2θ及23°2θ附近位置分別有一個單的吸收峰，且在17°2θ和18°2θ附近位置有相連的雙峰，這些均為A型晶體的特征吸收峰，說明生物酶的修飾并沒有改變淀粉顆粒的晶體類型。

圖1 微生物胞外酶修飾前(A)后(B)玉米粉中淀粉顆粒的電鏡觀察(2000×)Fig.1 Electronic microscope of corn starch particles before(A)and after(B)the modification by exocellular enzymes(2000×)

圖2 生物酶處理前(A)后(B)玉米粉中淀粉顆粒的X-射線衍射圖Fig.2 X-ray diffraction pattern of corn starch particles before(A)and after(B)the modification by exocellular enzymes

2.3 枯草芽孢桿菌胞外酶處理對玉米粉中淀粉及糖類的影響

玉米淀粉顆粒是由支鏈淀粉和直鏈淀粉2種高分子有序集合而成的，淀粉的組成即支鏈淀粉與直鏈淀粉的比例及直鏈淀粉的含量，對玉米粉的品質有很重要的影響[15]，實驗結果見圖3，枯草芽孢桿菌處理后玉米粉中淀粉和支鏈淀粉含量下降明顯，分別由對照組的70.72%、53.41%下降為酶修飾后的46.82%和27.51%，降幅分別為33.78%和48.49%。而直鏈淀粉的相對含量略有增加，由對照組的17.41%上升為酶修飾后的19.31%，增幅為10.91%，這可能是由于枯草芽孢桿菌分泌的淀粉酶絕大部分是α-淀粉酶，主要作用于支鏈淀粉，導致淀粉和支鏈淀粉的含量驟減，而直鏈淀粉變化不大，所以相對含量略有增加，也可能是干物質減少所造成的濃縮效應。閔偉紅等[16]通過對乳酸菌發(fā)酵大米淀粉的研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌發(fā)酵后大米淀粉中的直鏈淀粉含量增加，支鏈淀粉被降解，與本研究的結果類似?？莶菅挎邨U菌分泌的淀粉酶可以將玉米粉中的淀粉分解成可溶性糖，由圖4可知，隨著淀粉的分解，枯草芽孢桿菌胞外酶修飾產物中可溶性糖含量由對照的12.33%上升為31.02%，增幅為151.58%；還原糖含量由對照的4.31%上升為9.22%，增幅為113.92%；糊精含量由對照的4.01%上升為12.81%，增幅為219.45%。

圖3 枯草芽孢桿菌胞外酶處理前后玉米粉中淀粉組成的變化Fig.3 The change of starch components of corn flour before and after the modification by exocellular enzymes

2.4 枯草芽孢桿菌胞外酶處理前后玉米粉中氨基酸的變化

玉米粉經過枯草芽孢桿菌胞外酶修飾后，氨基酸的變化見表1，總氨基酸含量比對照增加了26.46%。其中，谷氨酸的含量增加比例最大，為84.57%，其次是酪氨酸增加了50%，賴氨酸增加了47.37%，丙氨酸增加了35.42%，纈氨酸增加了34.29%，苯丙氨酸增加了20.51%，異亮氨酸增加了13.79%，而精氨酸下降了28.57%。其余的氨基酸變化較小或基本上沒有變化。在帶有“*”的必需氨基酸中，僅有精氨酸的相對含量明顯下降，其他7種都有所增加，賴氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸的相對含量增加都達到20%以上。

表1 枯草芽孢桿菌處理前后玉米粉中氨基酸含量的變化Table 1 The change of amino acids contents of corn flour beforeand after the modification by exocellular enzymes

3 結論

枯草芽孢桿菌胞外酶對于玉米粉的修飾，只是破壞了其表面結構，在淀粉顆粒表面造成明顯的孔洞，并沒有引起淀粉顆粒完全崩潰。同時，也沒有改變淀粉顆粒的結晶類型。

玉米粉經過枯草芽孢桿菌胞外酶修飾后，其可溶性糖、還原糖及糊精含量都有顯著增加。而總淀粉和支鏈淀粉含量下降明顯，直鏈淀粉的相對含量略有增加。在氨基酸方面也是變化明顯，尤其是8種必需氨基酸中，除精氨酸外，其余都是有所增加，這些改變對于玉米粉及其制品食用及加工品質的影響都還有待于進一步研究。

[1]SHIKHA,SHARAN A,DARMWAL N S.Improved production of alkaline protease from a mutant of alkalophilicBacillus pantotheneticususing molasses as a substrate[J].Bioresource Technol,2007,98(4):881-885.

[2]牛春華，高 巖，李玉秋，等.紫外誘變選育高產蛋白酶枯草芽孢桿菌[J].中國釀造，2011，30（12）：67-69.

[3]MARCUS S,SINGH A,WARD O P.Developments in the use ofBacillusspecies for industrial production[J].Can J Microbiol,2004,50(1):1-17.

[4]SERAP O,DAVID S J.Functionality behavior of raw and extruded com starch mixtures[J].Cereal Chem,2005,82(2):223-227.

[5]寧正祥.食品成分分析手冊[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1998.

[6]趙 凱，徐鵬舉，谷廣燁.3，5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖含量的研究[J].食品科學，2008，29（8）：534-536.

[7]閆亞婷.固態(tài)發(fā)酵玉米條件的優(yōu)化及營養(yǎng)物質變化的比較研究[D].雅安：四川農業(yè)大學碩士論文，2010.

[8]SAHLSTROM S,BRATHEN E,LEA P,et al.Influence of starch granule size distribution on Bread characteristics[J].J Cereal Sci,1998,28(2):157-164.

[9]CARCEA M,CUBADDA R,ACQUISTUCCI R.Physiochemical and rheological characterization of sorghum starch[J].J Food Sci,1992,57(4):1024-1028.

[10]吳 俊，謝守和.玉米淀粉的粒度效應及其糊化行為影響研究[J].中國糧油學報，2006，21（1）：51-54.

[11]章華偉.蕎麥淀粉的加工工藝、特性及其改性研究[D].楊凌：西北農林科技大學博士論文，2003.

[12]曾 潔.玉米面粉面團品質特性及加工改良方法的研究[D].沈陽：沈陽農業(yè)大學博士論文，2007.

[13]魯戰(zhàn)會.生物發(fā)酵米粉的淀粉改性及凝膠機理研究[D].北京：中國農業(yè)大學博士論文，2002．

[14]張國權.蕎麥淀粉理化特性及改性研究[J].楊凌：西北農林科技大學博士論文，2007.

[15]SERAP O,DAVID S J.Functionality behavior of raw and extruded com starch mixtures[J].Cereal Chem,2005,82(2):223-227.

[16]閔偉紅.乳酸菌發(fā)酵改善米粉食用品質機理的研究[D].北京：中國農業(yè)大學博士論文，2003.