α-葡萄糖苷酶的制備工藝研究進(jìn)展

嚴(yán)曉娟，陳 朋，2*，梁 寧，胡先望

（1甘肅省商業(yè)科技研究所，甘肅蘭州，730010；2蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州，730020）

α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，EC.3.2.l.20）系統(tǒng)命名為α-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，又名α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶或麥芽糖酶，簡(jiǎn)稱α-糖苷酶。其在糖的催化反應(yīng)方面具有水解和轉(zhuǎn)糖苷雙重作用，可從α-葡萄糖苷、寡糖和葡聚糖的非還原性末端切開α-1，4糖苷鍵，釋放出葡萄糖或?qū)⒂坞x出的葡萄糖殘基以α-1，6糖苷鍵轉(zhuǎn)移到另一個(gè)糖類底物上，從而得到非發(fā)酵性的異麥芽低聚糖（isomalto-oligosaccharides，簡(jiǎn)稱IMO）、糖脂或糖肽等[1]。α-葡萄糖苷酶在自然界廣泛分布，種類繁多，幾乎存在于所有生物體內(nèi)。在人類的糖原降解及動(dòng)物、植物和微生物的糖類代謝方面具有重要的生理功能。目前，α-葡萄糖苷酶已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)和開發(fā)研究領(lǐng)域，主要包括生產(chǎn)低聚異麥芽糖、淀粉水解、酒精發(fā)酵、代謝機(jī)理研究、食品成分分析和醫(yī)學(xué)診斷等方面[2]。

不同來(lái)源的α-葡萄糖苷酶相對(duì)分子質(zhì)量差異很大，一般為40000u～150000u。pH值為3.0～5.0，但最適pH值可以超過7.0；多數(shù)具有較高的熱穩(wěn)定性和最適溫度，屬于鍵專一性酶，可專一性地切開糖類底物分子中的α-1，4糖苷鍵，個(gè)別種類的也可以作用于蔗糖的α-1，2糖苷鍵[3]。

1 α-葡萄糖苷酶的制備與提取

1.1 從植物中提取

植物中提取α-葡萄糖苷酶常用的方法包括醇法、水-醇法、醇吸附樹脂法、醇提-醚（酮）沉淀法、透析法、氧化鎂吸附法、葡聚糖凝膠法、大孔吸附樹脂法、硅膠柱層析法等[3]。從植物中提取α-葡萄糖苷酶的報(bào)道很少。

1.2 微生物發(fā)酵

目前，國(guó)外生產(chǎn)的α-葡萄糖苷酶大部分為純酶，酶活較高，而國(guó)內(nèi)對(duì)α-葡萄糖苷酶的研究集中在產(chǎn)酶菌株的誘變選育、分離純化、固定化酶、酶學(xué)性質(zhì)和基因工程菌方面[4-5]，主要以粗酶液為主，酶活較低。已開發(fā)的α-葡萄糖苷酶主要來(lái)源于黑曲霉、米曲霉、地衣芽孢桿菌和酵母，其中產(chǎn)酶較高的是黑曲霉[6-9]。將N+注入出發(fā)菌株誘變得到一株檸檬酸高產(chǎn)菌株黑曲霉LD20，將其在500L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，在35℃、300r/min、24h的發(fā)酵條件下，α-葡萄糖苷酶最高酶活可達(dá)到322.52U/mL[10]。實(shí)際生產(chǎn)中的α-葡萄糖苷酶主要來(lái)源于真菌，由于真菌的發(fā)酵周期較長(zhǎng)，酶的產(chǎn)量和特性不易控制，所以構(gòu)建和利用基因工程菌作為生產(chǎn)該酶制劑的宿主，成為該酶的研究熱點(diǎn)。α-葡萄糖苷酶基因的來(lái)源主要集中在嗜熱菌屬、曲霉屬、芽孢桿菌屬、腸桿菌等，表達(dá)所選用的宿主大多為大腸桿菌、畢赤酵母、釀酒酵母和其他絲狀真菌等。從阪崎腸桿菌（ATCC29544）中克隆到α-葡萄糖苷酶基因malA，將其克隆入表達(dá)載體pET22b（+），構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET22b-malA。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），得到的克隆的目的基因全長(zhǎng)1677bp，與Genbank的malA比較具有100%的同源性[11]。從腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesentcroidesATCC 8293）里克隆到編碼糖苷酶家族3保守區(qū)段的基因（Leum-0289），將該基因插入到表達(dá)載體pET28a（+）中，得到的重組α-葡萄糖苷酶具有高度的專一性，只能水解合成底物p-NPG[12]。

2 α-葡萄糖苷酶的純化

酶純化的常用方法有鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、離子交換層析、親和層析、凝膠過濾層析、疏水層析色譜、超濾技術(shù)、聚丙烯酰胺凝膠電泳等[13]。其中，鹽析和有機(jī)溶劑沉淀常用于酶的初級(jí)純化階段，離子交換層析、親和層析、凝膠過濾層析等方法，對(duì)于酶更高級(jí)別的純化效果好，常用于重組α-葡萄糖苷酶的分離純化，同時(shí)將幾種分離純化方法結(jié)合使用，能達(dá)到更理想的分離純化效果[14]。

2.1 硫酸銨沉淀

硫酸銨沉淀法是大部分酶在初級(jí)純化階段經(jīng)常采用的方法。由于硫酸銨沉淀對(duì)酶的活性損傷少，沉淀可長(zhǎng)時(shí)間保存，又可除去大部分雜蛋白，所以目前酶初純階段大多采用硫酸銨分級(jí)沉淀，該法純化操作簡(jiǎn)單，成本低廉，溫度系數(shù)小，不易使蛋白質(zhì)變性，但是分辨力差，酶中混雜大量鹽分，純化倍數(shù)不高[15]。

2.2 冷丙酮沉淀

在冰浴條件下，向酶抽提液中邊攪拌邊加入不同體積比的冷丙酮（-15℃），根據(jù)各種蛋白質(zhì)的溶解度不同，利用不同濃度的丙酮來(lái)沉淀不同的蛋白質(zhì)，從而達(dá)到分離純化的目的。該法分辨率高，可除去大量的雜蛋白和色素物質(zhì)。

2.3 離子交換層析

離子交換層析是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法，該法靈敏度高、重復(fù)性好、選擇性強(qiáng)、分析速度快，被廣泛應(yīng)用于酶和蛋白質(zhì)的分離純化中，常用于重組α-葡萄糖苷酶的分離純化。劉軍等[16]從嗜熱棲熱菌Thermus thermophilus中克隆耐熱α-葡萄糖苷酶基因hbg及在大腸桿菌中高效表達(dá)，采用鎳親和柱-陰離子交換柱純化重組表達(dá)的α-葡萄糖苷酶，經(jīng)SDS-PAGE分析表明，經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌有明顯的重組蛋白表達(dá)帶，純化后可見一條單一蛋白帶，預(yù)期分子量為61.798ku。郎國(guó)竣等[17]采用HD-1大孔酚醛系弱酸性陽(yáng)離子交換樹脂柱層析、HZ806大孔吸附樹脂柱層析、高效液相制備色譜等對(duì)編號(hào)為506157菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的活性成分進(jìn)行分離純化，得到的抑制劑純樣品純度可達(dá)95%以上。袁亞宏等[18]比較了Q-Sepharose Fast Flow和DE-52這兩種陰離子交換柱對(duì)1株Alicyclobacillus contaminans發(fā)酵產(chǎn)生的α-葡萄糖苷酶的分離純化效果，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱分離效果優(yōu)于DE-52層析柱。

2.4 親和層析

將具有特殊結(jié)構(gòu)的親和分子制成固相吸附劑放置在層析柱中，當(dāng)要被分離的蛋白混合液通過層析柱時(shí)，與吸附劑具有親和能力的蛋白質(zhì)就會(huì)被吸附而滯留在層析柱中，然后選用適當(dāng)?shù)南疵撘?，改變結(jié)合條件將被結(jié)合的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)，達(dá)到分離純化的目的。該法純化能力強(qiáng)大，活性蛋白的回收率高，可純化其他方法難以分離的蛋白質(zhì)[14]。常用于重組α-葡萄糖苷酶的分離純化。楊捷琳等[12]克隆獲得了阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶基因，通過構(gòu)建pET22b（+）-Glu表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得基因重組的高表達(dá)菌株，采用Ni-NTA親和柱純化目的蛋白，純化后純度達(dá)到了90%以上。

2.5 凝膠過濾層析

利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小不同來(lái)進(jìn)行分離。該法操作條件溫和，不需要有機(jī)溶劑，對(duì)于高分子物質(zhì)有很好的分離效果。常用于α-葡萄糖苷酶的分離純化。畢金峰等[19]探討了一種黑曲霉所產(chǎn)α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶粗酶的分離提純方法，采用葡聚糖凝膠G2200柱層析法分離粗酶液，用SDS2聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定純酶的分子質(zhì)量為130ku。

3 α-葡萄糖苷酶活性的測(cè)定

α-葡萄糖苷酶活力單位定義各異，按QB2525-2001《食品添加劑α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶》，酶活定義為1mL酶制劑于40℃、pH 5.0的條件下，1h作用α-甲基-D-葡萄糖昔生成1μg葡萄糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U/mL）。袁亞宏等[18]研究的α-葡萄糖苷酶活的測(cè)定方法：1個(gè)酶活力單位（U）為52℃、pH 5.4條件下，1min催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯酚需要的酶量。陳健旋等[20]研究的α-葡萄糖苷酶活測(cè)定方法：以每小時(shí)生成1μmol葡萄糖的酶量定義為1個(gè)單位，再測(cè)定濕固體曲水分，然后折算成U/g（干曲）表示其酶活。楊捷琳等[21]利用α-葡萄糖苷酶能夠分解4-硝基苯基-α-D-呋喃型葡萄糖的特性，在阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基上檢測(cè)表達(dá)純化后的蛋白活性。畢金峰等[22]用直接滴定法測(cè)定α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶作用于一定濃度的底物生成產(chǎn)物還原糖的量，用消耗反應(yīng)液體積來(lái)間接反映α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的酶活。

4 展望

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)α-葡萄糖苷酶研究主要集中在生產(chǎn)菌種的誘變選育、分離純化、固定化酶、酶學(xué)性質(zhì)和基因克隆表達(dá)等方面。微生物發(fā)酵是α-葡萄糖苷酶產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)，研究其生化性質(zhì)、轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)條件、純化方法，優(yōu)化發(fā)酵工藝和改造酶的特異性等方面，具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。由于國(guó)內(nèi)工業(yè)化生產(chǎn)α-葡萄糖苷酶的酶活很低，如何通過跨界融合技術(shù)、多重因素設(shè)計(jì)高效低成本的表達(dá)系統(tǒng)，研究酶的結(jié)構(gòu)與功能以及酶的固定化技術(shù)，對(duì)提高α-葡萄糖苷酶的研究至關(guān)重要。

表1 微生物提取α-葡萄糖苷酶Table 1 Microbial extraction of α-glucosidas

表2 α-葡萄糖苷酶的純化方法Table 2 This methods of purification of α-glucosidas

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