硝酸鹽對畜糞秸稈體系厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣的影響

謝 婷，饒康太，陳 雄，高順清，魯 江，王 志*

（1.湖北工業(yè)大學(xué)，湖北 武漢 430068；2.深圳華潤九新藥業(yè)有限公司，廣東 深圳 518049）

農(nóng)業(yè)廢棄物的增益化利用是循環(huán)生態(tài)農(nóng)業(yè)非常重要的環(huán)節(jié)，隨著我國農(nóng)業(yè)的發(fā)展，每年7億t的作物秸稈產(chǎn)量和預(yù)計到2020年將達(dá)到42億t的畜糞年排放量成為生態(tài)農(nóng)業(yè)資源化利用以及可持續(xù)發(fā)展亟待解決的問題和研究熱點(diǎn)[1]，如秸稈、畜糞等農(nóng)業(yè)廢棄物在厭氧條件下轉(zhuǎn)化為沼氣的研究[2-3]。雖然秸稈中存在纖維素和木質(zhì)素等分子形成的特殊結(jié)構(gòu)[4]和木質(zhì)素芳環(huán)降解物對厭氧菌群的毒性[5]以及畜糞秸稈厭氧體系易于“基質(zhì)酸化”等而使沼氣產(chǎn)量的穩(wěn)定性降低[6]，但是纖維素、木質(zhì)素等大分子還是可以被厭氧耦合菌系有效降解[7]?！盎|(zhì)酸化”從本質(zhì)上是厭氧體系細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸等小分子有機(jī)酸的能力大于甲烷菌群利用其為碳源和能源來合成甲烷的能力所造成[8]，因此可以通過大量補(bǔ)加產(chǎn)甲烷菌[9]和向酸化體系中補(bǔ)加能利用畜糞厭氧產(chǎn)氨的細(xì)菌[10]來緩解碳代謝失衡而降低酸化程度，但是由于兩者純培養(yǎng)的技術(shù)難度妨礙了其大規(guī)模應(yīng)用。

厭氧條件下，多數(shù)兼性厭氧菌（如芽胞桿菌、大腸桿菌、糞產(chǎn)堿菌、假單胞菌等）能將有機(jī)物氧化放出的電子傳遞給硝酸鹽同時釋放能量[11]。當(dāng)沒有硝酸鹽或其可獲得性不足時，兼性細(xì)菌可通過發(fā)酵作用將電子直接傳遞給中間產(chǎn)物，產(chǎn)生乙酸等小分子有機(jī)酸，而其在厭氧體系中被甲烷菌系利用而產(chǎn)生甲烷。當(dāng)該代謝耦合作用失衡時，酸化由此產(chǎn)生[8，12]。因此，硝酸鹽的可獲得性可能成為緩解或解決秸稈畜糞厭氧體系產(chǎn)沼氣系統(tǒng)酸化的易行方法。本文在秸稈畜糞厭氧發(fā)酵體系中添加硝酸鹽和兼性產(chǎn)氨菌株，考察其對厭氧發(fā)酵過程中基質(zhì)利用、體系pH值和揮發(fā)性脂肪酸（VFA）代謝以及沼氣產(chǎn)量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 發(fā)酵原料

水稻秸稈（含水率小于10%），粉碎后過40目篩后備用。新鮮牛糞（總固形物含量TS為15.6%）或/和豬糞（總固形物含量TS為13.9%）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)裝置

采用橡膠塞封口的250mL抽濾瓶作為反應(yīng)器，出氣口連接橡膠管并浸沒固定于15%NaOH溶液的量筒內(nèi)。抽濾瓶位置高于量筒，以免倒吸。反應(yīng)器置于37℃恒溫水浴鍋中。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵體系裝配

自然厭氧發(fā)酵體系：5g秸稈粉裝入250mL的抽濾瓶中，添加牛糞或/和豬糞（牛糞和豬糞混合時，其比例為2∶1）30g，加蒸餾水200mL后立即將瓶口用橡膠塞封閉，出氣橡膠管固定于集氣裝置。

以兼性氨化菌為接種物的秸稈畜糞發(fā)酵體系：5g秸稈粉裝入250mL的抽濾瓶中，添加牛糞和豬糞（混合比例2∶1）30g，接入在LB液體培養(yǎng)基中活化12h的兼性厭氧氨化菌——糞產(chǎn)堿菌（Af）或/和蘇云金芽孢桿菌（Bt）30mL（Af生物量為1.6g/L，Bt生物量是1.8g/L），再加蒸餾水170mL后立即將瓶口用橡膠塞封閉，出氣橡膠管固定于集氣裝置。

1.2.2 分析檢測方法

產(chǎn)沼氣量檢測：采用水壓法收集發(fā)酵產(chǎn)生的氣體，根據(jù)排出的15%NaOH溶液的體積定時記錄產(chǎn)氣量。

發(fā)酵液pH值：用pH值計測定。

揮發(fā)性脂肪酸（VFA）的檢測參照文獻(xiàn)[13-14]的方法進(jìn)行。

每組試驗(yàn)數(shù)據(jù)取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 秸稈畜糞（牛糞或/和豬糞）體系發(fā)酵產(chǎn)氣及體系pH值情況

秸稈畜糞（牛糞或/和豬糞）體系自然發(fā)酵產(chǎn)氣過程和最終pH值見圖1、圖2。

秸稈畜糞（牛糞或/和豬糞）體系自然發(fā)酵厭氧培養(yǎng)168h后培養(yǎng)體系的產(chǎn)氣趨勢基本相似，產(chǎn)氣量隨培養(yǎng)時間的延長而提高。牛糞、豬糞和牛糞/豬糞體系平均產(chǎn)氣速率分別為0.68mL/h、1.31mL/h和1.22mL/h，后兩者產(chǎn)氣效率比前者分別提高了93%和79%。這與后兩者所含成分比牛糞更富營養(yǎng)有關(guān)。如所分析的那樣，三者在厭氧發(fā)酵過程中均發(fā)生了嚴(yán)重的酸化現(xiàn)象，三者的最終pH值為5.1～5.6。產(chǎn)氣速率與pH值之間存在對應(yīng)關(guān)系，酸效應(yīng)的存在使得體系產(chǎn)氣效率下降。新鮮牛糞中含纖維質(zhì)比較多，而豬糞因含較多的蛋白類組分而緩解基質(zhì)酸化的程度，提高了菌群甲烷合成能力。但是，體系酸化仍然發(fā)生了。以牛糞體系pH值最低（5.13），豬糞和牛糞/豬糞體系pH值差異不大，在5.5左右。由于研究目標(biāo)是秸稈畜糞體系，因此選擇牛糞/豬糞（2∶1）作為發(fā)酵體系底物之一。

圖1 不同畜糞對體系厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣的影響Fig.1 Effect of straw and manure anaerobic fermentation system on the biogas production

圖2 不同畜糞對體系厭氧發(fā)酵pH值的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）Fig.2 Effect of straw and manure anaerobic fermentation system on pH value(Means±standard deviation)

基于對體系酸化機(jī)制的理解，通過補(bǔ)加前期篩選的兼性產(chǎn)氨細(xì)菌——糞產(chǎn)堿菌（Af）和蘇云金芽胞桿菌（Bt，同時接種2株菌的接種比例為1∶1）以觀察其對體系pH值和產(chǎn)氣的影響。

2.2 兼性氨化菌對秸稈畜糞體系發(fā)酵產(chǎn)氣及體系pH值的影響

體系接種糞產(chǎn)堿菌或/和蘇云金芽胞桿菌，秸稈畜糞體系厭氧發(fā)酵最終產(chǎn)氣量和pH值見圖3、圖4。

接種糞產(chǎn)堿菌或/和蘇云金芽胞桿菌，秸稈畜糞體系厭氧發(fā)酵168h的產(chǎn)氣趨勢基本相似，產(chǎn)氣量隨培養(yǎng)時間的延長而提高，產(chǎn)氣速率先加快，后逐漸減慢，最終產(chǎn)氣量分別為205mL、195mL和220mL，后者分別比前兩者提高了7.2%和12.8%。

圖3 接種兼性氨化菌對秸稈畜糞體系發(fā)酵產(chǎn)氣的影響Fig.3 Effects of facultative ammonifying bacteria addition on biogas production in the anaerobic straw and manure fermentation system

圖4 兼性氨化菌對秸稈畜糞體系pH值的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）Fig.4 Effects of facultative ammonifying bacteria addition on pH value in the anaerobic straw and manure fermentation system(Means±standard deviation)

添加糞產(chǎn)堿菌或/和蘇云金芽胞桿菌菌液后體系pH值不同，其中同時添加糞產(chǎn)堿菌和蘇云金芽胞桿菌體系的pH值最高，為5.83。添加糞產(chǎn)堿菌或蘇云金芽胞桿菌的pH值相當(dāng)，分別為5.70和5.76，均低于同時添加2種菌體系的pH值。

和圖2相比，接種兼性氨化菌的厭氧發(fā)酵體系的pH值均高于自然厭氧發(fā)酵體系的pH值，提高了2.9%～13.6%，可見接種兼性氨化菌有利于提高體系pH值，但pH值的緩沖效果仍然不理想，pH值仍在6.0以下。

由于在厭氧條件下，兼性厭氧菌如糞產(chǎn)堿菌和芽胞桿菌等能通過硝酸鹽呼吸來產(chǎn)生能量[11]及可能降低或緩解發(fā)酵產(chǎn)酸效應(yīng)。因此，選擇牛糞/豬糞（2∶1）和接種兼性產(chǎn)氨細(xì)菌——糞產(chǎn)堿菌和蘇云金芽胞桿菌為基本厭氧體系，觀察硝酸鹽和氨化菌接種量對體系pH值的影響。

2.3 硝酸鉀對秸稈畜糞接種氨化菌體系發(fā)酵產(chǎn)氣及體系pH值的影響

由于硝酸鉀、氨化菌的復(fù)合作用可能調(diào)節(jié)體系厭氧發(fā)酵的pH值，穩(wěn)定體系產(chǎn)氣效率，因此，對兩者進(jìn)行了初步優(yōu)化見表1。Af/Bt指糞產(chǎn)堿菌和芽胞桿菌接種菌液體積比例。

表1 加硝酸鉀和氨化菌對pH值的影響Table 1 Effects of potassium nitrate and ammoniation bacteria additions on pH value

表2 雙因素方差分析（α=0.05）Table 2 Variance analysis of two factor(α=0.05)

從表1可以看出，相同氨化菌接種比例時，體系pH值基本上都是隨著硝酸鉀添加濃度的增大而提高。硝酸鉀濃度是1g/L和3g/L時，pH值基本上不隨氨化菌接種比例的變化而變化。最優(yōu)組合方案是：2g/L硝酸鉀以及糞產(chǎn)堿菌/蘇云金芽孢桿菌為1∶2。此條件下，體系最終pH值最高，為7.12。

由表2可知，運(yùn)用Excel方差分析當(dāng)α=0.05時，硝酸鉀對體系pH值影響極為顯著。氨化菌只是具有厭氧硝酸鹽呼吸的能力，但是，當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境中硝酸鹽的可獲得性不足時，氨化菌并不能誘導(dǎo)并表現(xiàn)出硝酸鹽呼吸的功能，因而其單獨(dú)使用的緩沖pH值效果并不明顯。

最優(yōu)組合方案條件下體系產(chǎn)氣和pH值的情況見表3。

表3 硝酸鉀對秸稈畜糞接種兼性氨化菌體系發(fā)酵產(chǎn)氣及體系pH值的影響Table 3 Effects of nitrate addition on biogas production and pH value in straw manure inoculated with the facultative ammoniation bacteria system fermentation

由表3可知，優(yōu)化條件下厭氧發(fā)酵168h的產(chǎn)氣量為350mL，比對照組（只添加氨化菌）顯著提高了62.8%。培養(yǎng)結(jié)束時優(yōu)化組VFA含量為2.54g/L，比對照減少了13.0%。這也反映出更多的揮發(fā)性有機(jī)酸被甲烷菌群利用了，體系VFA的降低顯著緩沖了體系的pH值，發(fā)酵結(jié)束時，添加組pH值為7.12，比對照提高了22.8%。同時也表明：秸稈畜糞厭氧體系產(chǎn)沼氣的限制性因子不是體系VFA的生成效率，而是VFA積累到臨界濃度以上所造成的過低pH值。

硝酸鉀的加入使兼性厭氧菌群（包括糞產(chǎn)堿菌和芽胞桿菌）在厭氧體系的電子受體可獲得性增加，實(shí)現(xiàn)了電子由VFA合成途徑向硝酸鹽呼吸的代謝遷移[15-16]，緩沖了體系pH值，提高了厭氧菌系的代謝活性，促進(jìn)了有機(jī)物向沼氣轉(zhuǎn)化的效率。

3 結(jié)論

秸稈畜糞（牛糞或/和豬糞）體系厭氧發(fā)酵過程發(fā)生了基質(zhì)酸化現(xiàn)象，最終pH值為5.2～5.5，雖然接種兼性氨化菌的厭氧發(fā)酵體系比自然厭氧發(fā)酵體系的pH值提高了2.9%～13.6%，但體系pH值仍在6.0以下。當(dāng)硝酸鉀的添加量為2g/L以及氨化菌（糞產(chǎn)堿菌/蘇云金芽胞桿菌的接種比例為1∶2）時，厭氧發(fā)酵168h的產(chǎn)氣量為350mL，比對照組（只添加氨化菌）顯著提高了62.8%，此時VFA含量為2.54g/L，比對照減少了13.0%。這也反映出更多的揮發(fā)性有機(jī)酸被甲烷菌群利用了，體系VFA的降低顯著緩沖了體系的pH值，發(fā)酵結(jié)束時，添加組pH值為7.12，比對照提高了22.8%。

硝酸鉀對體系pH值影響極為顯著，而氨化菌只是具有厭氧硝酸鹽呼吸的能力，但是，當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境中硝酸鹽的可獲得性不足時，氨化菌并不能誘導(dǎo)并表現(xiàn)出硝酸鹽呼吸的功能，因而其單獨(dú)使用的緩沖pH值效果并不明顯。硝酸鉀的加入提高了體系pH值和厭氧菌系的代謝活性，促進(jìn)了有機(jī)物向沼氣轉(zhuǎn)化的效率。同時也說明秸稈畜糞厭氧體系產(chǎn)沼氣的限制性因子不是體系VFA的生成效率，而是VFA積累到臨界濃度以上所造成的過低pH值。

本研究結(jié)果為秸稈畜糞體系厭氧條件下因“基質(zhì)酸化”而使沼氣產(chǎn)量降低矛盾的解決提供了一種易行策略。

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