鴉膽子油乳誘導(dǎo)宮頸癌SiHa細胞的凋亡

劉博宇 金海國 李 忠 (吉林省腫瘤醫(yī)院放療研究室，吉林 長春 130012)

宮頸癌是嚴(yán)重威脅婦女健康的一種疾病，也是最多見的惡性腫瘤之一，居我國婦女惡性腫瘤的首位〔1〕。目前臨床上主要采用手術(shù)、放療及化療等方法對宮頸癌進行綜合治療，但臨床上缺乏不良反應(yīng)小的輔助治療藥物。鴉膽子油乳屬植物的種子，其主要成分為油酸和亞油酸。在臨床上廣泛應(yīng)用于對消化道腫瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌等惡性腫瘤的輔助治療〔2～4〕，在抗腫瘤的同時還具有提高機體免疫力作用〔5〕，但是目前尚未見用該藥治療宮頸癌的臨床報道。本研究通過觀察鴉膽子油乳對體外宮頸癌SiHa細胞的抑制，闡明其對誘導(dǎo)SiHa細胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 鴉膽子油乳(10 ml/支)由沈陽藥科大學(xué)制藥廠生產(chǎn)。宮頸癌SiHa細胞購自美國ATCC細胞庫。

1.2 細胞培養(yǎng) 選用人宮頸癌細胞系SiHa在含10%小牛血清、青霉素100 IU/ml、鏈霉素100 μg/ml中，在恒溫培養(yǎng)箱中以37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。每2天換液1次，當(dāng)細胞80%融合時用不含0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)的0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.3 增殖抑制實驗 鴉膽子油乳稀釋成3個不同質(zhì)量濃度實驗組，另設(shè)1個不加藥物的空白對照組。采用MTT法檢測細胞增殖抑制率。將Hela細胞轉(zhuǎn)移在96孔細胞培養(yǎng)板中，每個孔內(nèi)加入細胞懸液200 μl，在恒溫培養(yǎng)箱中以37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將藥物分別加入實驗孔中，設(shè)6個復(fù)孔，分別在24、48、72 h 后取出一個培養(yǎng)板，每孔加入 MTT 40 μl，孵育4 h后去上清。每個孔內(nèi)加入150 μl DMSO，振蕩10 min左右。然后用酶標(biāo)儀在550 nm處測定光密度值(D)。細胞生長抑制率(IR)=(實驗組D/對照組D)×100%。

1.4 流式細胞儀分析 取對數(shù)生長的SiHa細胞，將其接種于培養(yǎng)瓶中，分為不加藥物的空白對照組和3個實驗組。實驗組稀釋藥物濃度為10、30、50 μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集不同藥物濃度處理的Hela細胞，制成單細胞懸液，調(diào)細胞數(shù) ＞1×106/ml，冰PBS洗兩遍，70%冰乙醇固定過夜，加RNA酶及PI，避光染色30 min，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行F檢驗。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌SiHa細胞的增殖抑制實驗結(jié)果 隨著鴉膽子油乳濃度的增加，宮頸癌SiHa細胞抑制率逐漸增高。在同一藥物濃度作用下，隨著作用時間的延長，抑制率也隨著增高(P＜0.01)。見表1。

表1 鴉膽子油乳對宮頸癌SiHa細胞增殖抑制作用(± s，n=6)

表1 鴉膽子油乳對宮頸癌SiHa細胞增殖抑制作用(± s，n=6)

鴉膽子油乳24 h 48 h 72 h 10 μg/ml 33.15±0.96 63.67±0.31 85.33±1.21 30 μg/ml 37.43±1.62 68.32±0.26 88.57±2.04 50 μg/ml 42.76±4.21 70.43±1.28 90.74±0.92 F/P值83.88/＜0.01 165.3/＜0.01 201.31/＜0.01

2.2 宮頸癌SiHa細胞凋亡結(jié)果 鴉膽子油乳作用48 h后，同時G0/G1期比例顯著降低，S期比例顯著增高，G2/M期比例也有所增高。鴉膽子油乳10、30、50 μg/ml組作用48 h后凋亡率分別為(15.06±4.45)%、(46.42±6.21)%、(82.03±8.94)%，空白對照組細胞凋亡率僅為(0.87±0.56)%，實驗組的細胞凋亡率與空白對照組比較具有顯著差異(P＜0.01)。

3 討論

宮頸癌的發(fā)生與人乳頭瘤病毒(HPV)的感染、原癌基因的激活、p53抑癌基因分子突變、一些化學(xué)致癌物等多種因素有關(guān)〔6〕。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在90%以上的人宮頸癌標(biāo)本中檢測出 HPV DNA〔7〕，其中以 HPV16 型最突出〔8〕。目前放療及化療已在臨床上廣泛應(yīng)用于治療此類宮頸癌，并且療效已得到認可，但其對機體的毒副作用也較大，往往影響患者的生存質(zhì)量。

鴉膽子油乳是一種抗癌藥物，其成分中所包含的鴉膽亭、鴉膽子苦酸等均對癌細胞的DNA、RNA以及蛋白質(zhì)合成具有抑制作用〔9～11〕。我國于1978年開始研制鴉膽子油靜脈乳劑〔12〕，并在臨床上主要用于食管癌、腸癌、肝癌、肺癌、腦轉(zhuǎn)移癌等的治療。該藥物與放療、化療相比具有毒副作用小，療效好等優(yōu)勢〔13〕。但目前對鴉膽子油乳治療HPV相關(guān)的宮頸癌的臨床報道罕見。本研究結(jié)果表明，鴉膽子油乳可明顯抑制SiHa細胞的生長，其抑制程度隨藥物濃度及藥物作用時間的增加而增加。在相同作用時間下，隨著藥物濃度的增加SiHa細胞凋亡率明顯增加。這一結(jié)果與王曉娜等〔14〕的結(jié)果相似。

1 谷銑之，殷蔚伯，余子豪，等.腫瘤放射治療學(xué)〔M〕.第4版.北京:中國協(xié)和大學(xué)出版社，2008:1007-49.

2 Tibaldi C，Ricci S，Russo F，et al.Increased dose-intensity of gemcitabine in advanced non small cell lung cancer(NSCLC):a multicenter phaseⅡstudy in elderly patients from the“polmone toscano group”(POLTO)〔J〕.Lung Cancer，2005;48(1):121-7.

3 丁新梅，武長軍，王鶴鵬，等.TACE聯(lián)合鴉膽子油乳注射液治療原發(fā)性肝癌的療效觀察〔J〕.中國誤診學(xué)雜志，2008;8(14):3314-5.

4 Kato H，Tachimofi Y，Watanabe H，et al.Recurrent esophageal carcinoma after esophagectomy with three-field lymph node dissection〔J〕.J Surg Oncol，1996;61(4):267-72.

5 張宏勝.鴉膽子油乳注射液聯(lián)合化療對食管癌術(shù)后患者免疫功能的影響〔J〕.海軍醫(yī)學(xué)雜志，2007;28(1):31-3.

6 Dellas A，Scheetheiss E，Almendral A，et al.Altered expres-sion of MDM2 and its association with p53 protein status，tu-mor-cell-proliferation rate and prognosis in cervical neoplasia〔J〕.Cancer，1997;74(9):42125.

7 李 力.宮頸癌與人乳頭瘤病毒感染〔J〕.中國實用婦科與產(chǎn)科雜志，2006;22(1):13-5.

8 Muoz N，Bosch FX，de Sanjosé S，et al.Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer〔J〕.N Eng J Med，2003;348(6):518-27.

9 陳曉萍.鴉膽子油乳劑治療肺癌胸水療效觀察〔J〕.中國基層醫(yī)藥，2006;13(2):193-4.

10 林宏英.鴉膽子油的研究進展〔J〕.中國實驗方劑學(xué)雜志，2006;12(4):65-9.

11 毛建林.鴉膽子油乳劑治療惡性胸腔積液25例臨床分析〔J〕.實用腫瘤雜志，2004;19(2):158-9.

12 吳松昌，林震瓊，曹毓芬，等.術(shù)前靜脈滴注鴉膽子油乳劑治療肺癌的臨床病理研究〔J〕.上海醫(yī)學(xué)，1991;14(5):271-3.

13 崔勇志，張玲華，陸景明.中藥鴉膽子油乳劑對人卵巢癌細胞株CAov3的毒性作用〔J〕.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1997;26(1):82.

14 王曉娜，馬 力，安春麗，等.鴉膽子油乳對宮頸癌SiHa細胞的抑制〔J〕.中國腫瘤生物治療雜志，2009;16(5):497-7.