海人酸癲癇大鼠海馬組織的蛋白質(zhì)組學(xué)

李 欣 羅海龍 陳雪寒 楊印東 關(guān)亞新

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)一科，黑龍江 佳木斯 154002)

顳葉癲癇(TLE)約占癲癇發(fā)病的40%以上，藥物難以控制。該病病情復(fù)雜多樣、發(fā)作時(shí)間不確定和癥狀表現(xiàn)短暫，難以準(zhǔn)確診斷，易出現(xiàn)誤診漏診。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)實(shí)質(zhì)上是一種雙向電泳(2-DE)診斷技術(shù)，作為目前唯一同時(shí)檢測(cè)大量蛋白復(fù)合物定量表達(dá)情況的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，已得到廣泛性的應(yīng)用。2-DE與質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合在疾病特異性標(biāo)志物、發(fā)病機(jī)制和臨床治療等多方面有明顯優(yōu)勢(shì)。本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究海人酸TLE大鼠海馬組織蛋白質(zhì)的差異性表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 20只健康Wistar大鼠均購(gòu)自牡丹江醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，2月齡，體質(zhì)量為(200±20)g，清潔級(jí)，由專人飼養(yǎng)。十二烷基硫酸鈉(DS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、二硫蘇糖醇(DTT)、Sample grinding kit試劑盒、蛋白質(zhì)定量試劑盒、固相pH梯度干膠條和CyDye染料均購(gòu)自Amersham Biosciences公司，苯甲基磺酰氟化物購(gòu)自Sigma公司。

1.2 分組及造模方法 隨機(jī)分為對(duì)照組和TLE模型組，各10只。模型組選擇戊巴比妥腹腔注射完全麻醉處理后，穩(wěn)妥予以固定，選擇左側(cè)海馬CA3區(qū)作為藥物注射點(diǎn)，緩慢注入1 μl體積的海人酸，注射時(shí)間控制在5 min內(nèi)，注射完后將皮膚縫合;對(duì)照組采用相同方法，注射等體積的生理鹽水溶液〔1〕。

1.3 海馬組織蛋白提取方法 在癲癇臨床癥狀發(fā)作終止24 h后，斷頭處死所有實(shí)驗(yàn)大鼠，徹底分離出海馬組織。研磨處理好海馬組織后，加入一定劑量的腦組織裂解液，繼續(xù)研磨1 min，冰上放置10 min，4℃條件下高速離心10 min，吸取上清液在-80℃冰箱里保存?zhèn)溆?。各組實(shí)驗(yàn)大鼠腦海馬組織樣品采用Bradford法對(duì)蛋白予以定量檢測(cè)，按說(shuō)明書(shū)操作。

1.4 蛋白標(biāo)記方法 吸取50 μg各大鼠海馬組織蛋白樣品置入離心管中，依次加入各種熒光染料工作液，完全混勻后放置在冰上避光反應(yīng)0.5 h，后加入賴氨酸終止反應(yīng)。最后加入相同體積的普通裂解液，置于冰上避光反應(yīng)10 min。

1.5 雙向電泳檢測(cè) 海馬組織蛋白樣品定容至450 μl后行等電聚焦處理，后取出IPG膠條放置在5 ml平衡液中烷基化反應(yīng)15 min。將平衡處理后的IPG膠條置于濃度為12.5%的聚丙烯酰胺凝膠上方，使用溴酚藍(lán)和瓊脂糖予以封頂，最后行SDS-PAGE電泳反應(yīng)，一直到溴酚藍(lán)指示線跑至聚丙烯酰胺凝膠底部邊緣時(shí)終止電泳。

1.6 掃描及差異點(diǎn)分析 蛋白組織電泳結(jié)束后，對(duì)聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行掃描，使用專業(yè)軟件對(duì)兩組大鼠海馬組織蛋白質(zhì)的掃描圖像予以分析，表達(dá)水平相差超過(guò)兩倍者可認(rèn)為差異點(diǎn)。

1.7 凝膠復(fù)染和質(zhì)譜分析鑒定 采用考馬斯亮藍(lán)對(duì)所有凝膠進(jìn)行染色，脫色處理后透射掃描，然后應(yīng)用分析軟件對(duì)凝膠點(diǎn)的差異性予以分析和比較，采集差異性蛋白質(zhì)點(diǎn)后脫水處理至白色狀，將蛋白組織樣品濃縮處理至0.5 μl，一定時(shí)間干燥后在質(zhì)譜儀上進(jìn)行分析，獲得圖譜后鑒定蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果

TLE大鼠海馬組織中共檢測(cè)出15個(gè)差異性表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中9個(gè)表達(dá)上調(diào)，6個(gè)表達(dá)下調(diào)，見(jiàn)表1。

表1 海人酸TLE大鼠海馬差異蛋白質(zhì)譜結(jié)果

3 討論

蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)的檢測(cè)目標(biāo)是蛋白質(zhì)組，主要分析組織器官或機(jī)體細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成成分的動(dòng)態(tài)變化情況、蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和修飾的具體狀態(tài)，進(jìn)而揭示各種蛋白質(zhì)成分相互之間的作用與聯(lián)系，并且可在整體上探討蛋白質(zhì)組成和調(diào)控等方面的活動(dòng)規(guī)律。疾病在出現(xiàn)臨床癥狀、體征之前，機(jī)體某些蛋白質(zhì)在組織結(jié)構(gòu)、表達(dá)水平、修飾方式和相互作用等方面均發(fā)生明顯變化。臨床上通過(guò)對(duì)處于不同狀態(tài)下的細(xì)胞、體液或器官組織的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行比較分析，即可辨別出與某些疾病具有高度相關(guān)性的特異蛋白質(zhì)分子，進(jìn)而為揭示疾病發(fā)病機(jī)制、臨床診治以及疾病預(yù)后評(píng)估等方面提供可靠實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。

海馬組織是人體腦組織邊緣系統(tǒng)的一部分，與日常學(xué)習(xí)記憶、情感表達(dá)波動(dòng)、應(yīng)激性反應(yīng)和老化等均有密切的聯(lián)系，是目前多種相關(guān)性疾病的研究重點(diǎn)。包含人類在內(nèi)的多種哺乳動(dòng)物海馬組織蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫(kù)已陸續(xù)建立〔2～4〕。TLE病理特點(diǎn)主要為機(jī)體海馬區(qū)域的腦細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)發(fā)生異常表現(xiàn)，也稱為海馬硬化表現(xiàn)。臨床上采用外科方式予以治療，大部分癇性發(fā)作可得到有效控制。但是海馬硬化表現(xiàn)是導(dǎo)致TLE發(fā)生的誘因還是TLE疾病發(fā)展的最終結(jié)果，目前仍未研究清楚。國(guó)外研究人員采用2-DE聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)對(duì)內(nèi)側(cè)TLE患者海馬區(qū)域的蛋白質(zhì)組學(xué)變化進(jìn)行相關(guān)性研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞骨架蛋白、載脂蛋白A-I、細(xì)胞內(nèi)?；o酶A硫酯水解酶和腦衰蛋白反應(yīng)介導(dǎo)蛋白-2等表達(dá)水平均出現(xiàn)明顯異常〔5～8〕，這些研究發(fā)現(xiàn)有利于揭示內(nèi)側(cè)TLE的發(fā)病作用機(jī)制。本研究共檢測(cè)出15種差異性蛋白質(zhì)在神經(jīng)細(xì)胞損傷、機(jī)體能量代謝過(guò)程和氧化應(yīng)激反應(yīng)等多個(gè)方面均發(fā)揮著極為重要的作用，證實(shí)了海人酸TLE大鼠海馬組織中存在許多差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，可能與癲癇的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。

1 吳春風(fēng)，黃松明，鄭 幗，等.海人酸致癇大鼠海馬及腦脊液谷氨酸及天冬氨酸變化的意義〔J〕.實(shí)用兒科臨床雜志，2007;22(24):1869-70.

2 Yang JW，Czech T，Lubec G.Proteomic profiling of human hippocampus〔J〕.Electrophoresis，2004;25(7 ～8):1169-74.

3 Fountoulakis M，Tsangaris GT，Maris A，et al.The rat brain hippocampus proteome〔J〕.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2005;819(1):115-29.

4 Pollak DD，John J，Hoeger H，et al.An integrated map of the murine hippocampal proteome based upon five mouse strains〔J〕.Electrophoresis，2006;27(13):2787-98.

5 Yang JW，Czech T，F(xiàn)elizardo M，et al.Aberrant expression of cytoskeleton proteins in hippocampus from patients with mesial temporal lobe epilepsy〔J〕.Amino Acids，2006;30(4):477-93.

6 Yang JW，Czech T，Gelpi E，et al.Extravasation of plasma proteins can confound interpretation of proteomic studies of brain:a lesson from apo AI in mesial temporal lobe epilepsy〔J〕.Brain Res Mol Brain Res，2005;139(2):348-56.

7 Yang JW，Czech T，Yamada J，et al.Aberrant cytosolic acyl-CoA thioester hydrolase in hippocampus of patients with mesial temporal lobe epilepsy〔J〕.Amino Acids，2004;27(3 ～4):269-75.

8 Czech T，Yang JW，Csaszar E，et al.Reduction of hippocampal collapsin response mediated protein-2 in patients with mesial temporal lobe epilepsy〔J〕.Neurochem Res，2004;29(12):2189-96.