高脂血癥對(duì)腦缺血大鼠模型腦皮質(zhì)MMP-2表達(dá)和神經(jīng)元凋亡的影響

張振強(qiáng) 宋軍營(yíng) 賈亞泉 李澎濤 潘彥舒 (河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 4500046)

缺血性腦病成為嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的慢性流行性疾病之一，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜。近年研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血后的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，缺血半暗帶或梗死區(qū)周?chē)纳窠?jīng)元死亡主要以凋亡性死亡為主，這提示了腦缺血損傷與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)〔1〕。因此，對(duì)腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制及基于抗凋亡為靶點(diǎn)的抗腦缺血的研究成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。Bcl-2蛋白家族主要參與線粒體引起的凋亡途徑，Bcl-2和Bax參與了腦出血后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。Bcl-2通過(guò)阻斷細(xì)胞凋亡而促進(jìn)細(xì)胞存活，維持細(xì)胞生存;而B(niǎo)ax與 Bcl-2功能相反，則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，Bcl-2與Bax的比值變化決定細(xì)胞的凋亡與生存〔2〕。近年來(lái)，基質(zhì)金屬酶(MMPs)，尤其是MMP-2，在缺氧缺血性腦損傷及腦水腫中所起的作用，逐漸被人們所關(guān)注。MMP-2即72kDa IV型膠原酶，由肥大的星形細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、缺血的內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等合成和分泌。其過(guò)度表達(dá)不僅能夠引起微血管的損失，而且破壞神經(jīng)細(xì)胞賴以生存的環(huán)境，并對(duì)炎癥因子發(fā)揮正反饋?zhàn)饔茫鼓X缺血后炎癥發(fā)生，加速神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔3〕。高脂血癥和高黏滯血癥是缺血性心腦血管病的重要原因。因此，本文在高脂血癥的病理基礎(chǔ)上探討腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為正常組(C1)、高脂對(duì)照組(H1)、假手術(shù)組(C2)、高脂假手術(shù)組(H2)、單純腦缺血組(I3和I7)、復(fù)合腦缺血組(H+I3和H+I7)。其中對(duì)照組與假手術(shù)組每組10只;模型組設(shè)兩個(gè)時(shí)間組，分別為腦缺血手術(shù)后3 d(I3和H+I3)和7 d(I7和H+I7)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)15只動(dòng)物(按預(yù)實(shí)驗(yàn)死亡率25%計(jì)，保證造模成功后取材的動(dòng)物數(shù))。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備 健康雄性SPF級(jí)Wistar大鼠，體重280～300 g，購(gòu)買(mǎi)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)為:SCXK(京)2007-0001，質(zhì)量合格證號(hào):0243109。高脂血癥組大鼠每天以高脂飼料(組成:3.5%膽固醇、10%豬油、0.2%丙硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉、5%白糖、80.8%基礎(chǔ)飼料)喂養(yǎng)，正常對(duì)照組以清潔級(jí)正常飼料喂養(yǎng)。

大鼠以10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈缺血模型(MCAO)。動(dòng)物仰臥固定，頸部正中切口，分離并暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)、外動(dòng)脈，結(jié)扎頸總動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈根部，由頸總動(dòng)脈近分叉處剪一小口插入尼龍線(長(zhǎng)50 mm，直徑0.26 mm，18 mm處作標(biāo)記)，插入長(zhǎng)度約(18±0.5)mm時(shí)感到有輕微阻力時(shí)停止，扎緊并固定插線，縫合皮膚。

模型制備成功后，每組各取動(dòng)物5只，以10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，背位固定于鼠板上，腹主動(dòng)脈取血5 ml，靜置 30 min，以 3 000 r/min，離心 15 min，取上清液，-20℃冰箱冷凍備用。每組再各取動(dòng)物5只，以10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，背位固定于鼠板上，剪開(kāi)胸腔，暴露出心臟，先用手術(shù)剪剪開(kāi)右心耳，再用100 ml注射器進(jìn)入左心室插進(jìn)主動(dòng)脈，先灌注生理鹽水150 ml左右，再灌注多聚甲醛400 ml左右;斷頭取出全腦，腦組織經(jīng)過(guò)常規(guī)脫水透明，制備蠟塊，備用。

1.3 神經(jīng)功能評(píng)分 對(duì)造模大鼠蘇醒后和取材前分別進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照Longa的5級(jí)評(píng)分方法評(píng)定動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)功能。0級(jí):無(wú)體征;1級(jí):動(dòng)物左側(cè)前肢不能完全伸展;2級(jí):左前膚癱瘓，出現(xiàn)追尾現(xiàn)象;3級(jí):肢體癱瘓，不能站立;4級(jí):動(dòng)物昏迷，無(wú)自主性活動(dòng)。評(píng)分為1級(jí)到3級(jí)的動(dòng)物為造模成功，入組，于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)再次評(píng)分后取材。計(jì)算方法:以各組動(dòng)物造模蘇醒時(shí)、取材前兩次評(píng)分進(jìn)行組間比較。

1.4 免疫組化 腦組織片按上面的時(shí)間步驟進(jìn)行脫蠟脫水;3%H2O237℃孵育 10 min，阻斷滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液微波修復(fù)抗原12 min自然冷卻20 min以上;正常羊血清工作液封閉，37℃ 20 min，吸去多余液體，勿洗。兔多克隆抗體 MMP-2(1∶200)，Bcl-2(1∶200)和Bax(1∶100)4℃冰箱孵育過(guò)夜，PBS沖洗3×5 min(用 PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照);生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育60 min，HRP標(biāo)記鏈親和素孵育60 min，DAB顯色液反應(yīng)染色。蘇木精染核，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。所有結(jié)果在10倍，40倍物鏡下觀察，采用40倍物鏡拍照。采用Lmageproplus 6.0圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)平均光密度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果 見(jiàn)表1。對(duì)各模型組造模蘇醒后及3、7 d取材前評(píng)分進(jìn)行比較，各組間沒(méi)有明顯差異(P＞0.05);復(fù)合腦缺血組與單純腦缺血組在造模蘇醒后和3、7 d取材前評(píng)分差值比較，3 d時(shí)組間沒(méi)有明顯差別(P＞0.05)，7 d時(shí)組間比較差值增大，差異顯著(P＜0.05)。

表1 各組造模蘇醒后和相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材前的神經(jīng)功能評(píng)分差異(± s，n=5)

表1 各組造模蘇醒后和相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材前的神經(jīng)功能評(píng)分差異(± s，n=5)

與單純腦3 d組相比較:1)P＜0.05

組別 造模蘇醒后評(píng)分 取材前評(píng)分 差值C2 0 0 0 I3 2.00±0.17 1.83±0.11 0.16±0.11 I7 1.92±0.15 1.67±0.14 0.25±0.13 H2 0 0 0 H+I3 2.00±0.17 1.58±0.15 0.41±0.15 H+I7 2.08±0.19 1.42±0.15 0.67±0.141)

圖1 大鼠腦皮質(zhì)梗死邊緣區(qū)MMP-2表達(dá)(×400)

2.2 高脂血癥病理?xiàng)l件下腦缺血組織中MMP-2的表達(dá)變化與正常(21.77±1.51)及假手術(shù)組(30.90±1.94)相比，MMP-2在單純腦缺血組(85.93±2.47)、(70.87±3.07)、高脂血癥組(44.32±1.99)、(54.61±4.02)和復(fù)合腦缺血組(80.82±2.95)、(99.68±2.54)的表達(dá)顯著增多(P＜0.05)，與高脂血癥及高脂血癥假手術(shù)相比，復(fù)合腦缺血組的MMP-2的表達(dá)也是明顯增多的(P＜0.05)，且MMP-2在復(fù)合腦缺血7 d組的表達(dá)顯著高于在單純腦缺血組的表達(dá)。這些結(jié)果表明高脂血癥的病理?xiàng)l件可能對(duì)MMP-2的表達(dá)有影響，見(jiàn)圖1。

2.3 高脂血癥病理?xiàng)l件下腦缺血組織中Bcl-2和Bax的表達(dá)變化 見(jiàn)表2和圖2。假手術(shù)的Bcl-2和Bax表達(dá)量都很少，但是，Bcl-2和Bax在單純腦缺血、高脂血癥和復(fù)合腦缺血組均有表達(dá)，而且差異顯著(P＜0.05)。與單純腦缺血相比，復(fù)合腦缺血組的Bax的表達(dá)顯著下降(P＜0.01)，Bcl-2的下降幅度小于Bax，復(fù)合腦缺血7 d尤為顯著。因此，Bcl-2/Bax比值升高，差異顯著(P＜0.05)。這些結(jié)果說(shuō)明腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡程度主要由Bcl-2/Bax比值變化決定，高脂血癥對(duì)腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡有一定的影響作用。

表2 大鼠腦皮質(zhì)梗死邊緣區(qū)Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)(± s，n=5)

表2 大鼠腦皮質(zhì)梗死邊緣區(qū)Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)(± s，n=5)

與C2組相比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01)，與 I3組相比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01;與I7組比較:5)P ＜0.05，6)P ＜0.01;與 H2組比較:7)P ＜0.05，8)P ＜0.01

組別Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax C2 14.84±1.45 18.86±2.06 1.05±0.04 I3 57.17±2.802) 86.37±3.132) 0.46±0.021)I7 77.02±4.112)3) 88.70±4.572) 0.56±0.023)H2 48.05±3.082)3)5) 44.91±3.104)6) 0.98±0.042)6)H+I3 67.72±3.172)3)5) 63.38±3.572)4)6)8) 0.61±0.031)3)7)H+I7 74.04±2.352)3)7) 53.16±3.202)4)6)7)0.73±0.021)3)5)7)

圖2 大鼠腦皮質(zhì)梗死邊緣區(qū)Bcl-2、Bax的蛋白表達(dá)(×400)

3 討論

腦缺血后缺血部位神經(jīng)元死亡的形式主要是壞死和凋亡。腦缺血時(shí)缺血中心區(qū)神經(jīng)元以壞死為主，而缺血半暗帶區(qū)則以神經(jīng)元凋亡為主要形式〔4，5〕。高脂血癥從發(fā)病機(jī)制的特點(diǎn)來(lái)看，一方面已經(jīng)發(fā)生了腦組織的相對(duì)缺血缺氧及炎癥反應(yīng)，另一方面引起血管損傷并激活血管內(nèi)皮細(xì)胞。這些特征與急性腦缺血的主要病理過(guò)程相似。但是，目前還不清楚缺血前腦部是否已經(jīng)激活了相應(yīng)的腦保護(hù)機(jī)制而出現(xiàn)“預(yù)處理”(pretreatment)或“預(yù)適應(yīng)”(preconditioning)效果。

腦缺血后，隨著病程進(jìn)展，缺血壞死組織通過(guò)組織水解酶及炎癥細(xì)胞吞噬、消化和吸收，梗死體積縮小，神經(jīng)功能有所恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)顯示，復(fù)合腦缺血模型組與單純腦缺血組在各時(shí)間點(diǎn)對(duì)比，神經(jīng)功能評(píng)分沒(méi)有顯著性差異，但缺血后7 d和3 d的差值比較，復(fù)合腦缺血模型組差值增大，差異顯著，缺血后3 d無(wú)顯著差異。復(fù)合腦缺血模型組與單純腦缺血組比較，缺血后7 d梗死體積縮小，差異顯著。結(jié)果表明，復(fù)合腦缺血在神經(jīng)功能恢復(fù)及梗死體積改善方面優(yōu)于單純腦缺血組?？赡芘c炎癥反應(yīng)在缺血不同時(shí)期表達(dá)變化有關(guān)，也可能與高脂血癥病變期誘發(fā)體內(nèi)的某些保護(hù)機(jī)制有關(guān)。

筆者的研究結(jié)果顯示，Bcl-2、Bax在伴有腦缺血模型各時(shí)間點(diǎn)均有高表達(dá)，復(fù)合腦缺血組和單純腦缺血組與相應(yīng)假手術(shù)組組內(nèi)比較，差異顯著(P＜0.05);復(fù)合腦缺血組與單純腦缺血組比較，表達(dá)下降，缺血后3 d、7 d組間差異顯著(P＜0.05)，Bcl-2/Bax比值升高，在缺血后7 d組間差異顯著(P＜0.05)。腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Bcl-2/Bax比值升高，對(duì)神經(jīng)元有保護(hù)作用。復(fù)合腦缺血與單純腦缺血在梗死邊緣區(qū)神經(jīng)元凋亡較少，提示高脂血癥可能通過(guò)炎癥因子上調(diào)體內(nèi)抗凋亡基因或下調(diào)促凋亡基因的表達(dá)，或炎癥因子刺激小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌一些對(duì)缺血腦組織損傷修復(fù)作用的物質(zhì)，如MMP-2〔6〕。

炎癥細(xì)胞因子(IL-6、TNF-α)、趨化因子(MCP-1、IL-8)等可通過(guò)基因調(diào)控 Bcl-2和 Bax的蛋白，從而影響神經(jīng)元的存活〔7，8〕。而這些炎癥因子也可能在腦缺血缺氧后引起 MMP-2的活化，激活的MMP-2進(jìn)而導(dǎo)致血腦屏障打開(kāi)，使炎癥因子及炎癥細(xì)胞透過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)腦組織，使?jié)撛诘腗MP-9激活，加重血腦屏障的滲透性，加速了神經(jīng)元的死亡。也有研究表明MMPs能夠直接誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，而且認(rèn)為MMP-9的表達(dá)與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡同步，參與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡過(guò)程，但是MMP-2的表達(dá)較晚，不直接與神經(jīng)元的凋亡有關(guān)，可能參與了腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)〔9〕。筆者的研究表明腦缺血后MMP-2的表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，MMP-2在復(fù)合腦缺血7 d組的表達(dá)也較為顯著(P＜0.05)。也有最新研究，在高脂血癥小鼠模型的缺血性微血管中，MMP-2的表達(dá)被激活，但是MMP-2激活可能加重了高脂血癥引起的血腦屏障的滲透性〔10〕。這提示了高脂血癥的基礎(chǔ)病理?xiàng)l件能夠影響MMP-2的表達(dá)，也提示了高脂血癥發(fā)病機(jī)制可能存在腦缺血缺氧現(xiàn)象。MMP-2表達(dá)的增加可能參與了復(fù)合腦缺血的神經(jīng)元修復(fù)，對(duì)腦組織細(xì)胞具有保護(hù)作用。因此，明確高脂血癥的發(fā)病機(jī)制及MMP-2在高脂血癥復(fù)合腦缺血的作用機(jī)制還需要做深入研究。

高脂血癥引起的中風(fēng)〔11〕，其病機(jī)也主要為痰瘀互結(jié)，進(jìn)而導(dǎo)致化毒損絡(luò)〔12〕?！岸緭p腦絡(luò)”的現(xiàn)代生物學(xué)依據(jù)主要表現(xiàn)為腦缺血后發(fā)的生物級(jí)連反應(yīng)，產(chǎn)生的大量自由基和代謝物質(zhì)，這些物質(zhì)積聚成為有害的毒性物質(zhì)〔11，13〕。毒性物質(zhì)也可以損傷神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元〔14〕。這為中醫(yī)藥防治和治療高脂血癥復(fù)合腦缺血/中風(fēng)提供理論依據(jù)。

總之，本研究表明復(fù)合腦缺血組與單純腦缺血組比較，在缺血7 d梗死體積縮小，神經(jīng)功能及腦組織損傷恢復(fù)較快，Bcl-2/Bax比值升高，MMP-2的表達(dá)明顯增加，可能與高脂血癥在痰瘀基礎(chǔ)上，激發(fā)機(jī)體抵抗病邪有關(guān)，也有可能是在痰瘀基礎(chǔ)上合并腦缺血后一定時(shí)間的特殊表現(xiàn)，其遠(yuǎn)期結(jié)果尚需進(jìn)一步研究。本研究為運(yùn)用中醫(yī)治療中風(fēng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了理論基礎(chǔ)。

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