促炎基因ALOX5AP多態(tài)性與腦卒中伴動(dòng)脈粥樣硬化患者功能恢復(fù)的相關(guān)性

王建華 (唐山市工人醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 唐山 063000)

動(dòng)脈粥樣硬化是導(dǎo)致腦卒中的重要因素，流行病學(xué)研究顯示了多種重要環(huán)境和遺傳危險(xiǎn)因子如脂質(zhì)代謝異常、高血壓、糖尿病、肥胖等均同動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)聯(lián)〔1〕。炎癥作用是一個(gè)關(guān)鍵性的致病機(jī)制。國內(nèi)關(guān)于腦卒中綜合危險(xiǎn)度評(píng)估及干預(yù)方案的研究中發(fā)現(xiàn)5-脂氧酶激活蛋白基因變異對(duì)腦卒中伴動(dòng)脈粥樣硬化有一定的影響。本研究現(xiàn)將針對(duì)促炎基因ALOX5AP多態(tài)性同腦卒中伴動(dòng)脈粥樣硬化患者功能恢復(fù)的關(guān)系進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2007年5月至2009年12月我院收治的腦卒中患者78例。其中35例合并動(dòng)脈粥樣硬化，43例單純腦卒中患者中男性26例，女性17例，年齡56～71〔平均(63.5±12.4)〕歲;合并動(dòng)脈粥樣硬化患者中男性21例，女性15例，年齡58～72〔平均(61.2±15.3)〕歲。腦卒中入選標(biāo)準(zhǔn):符合第四屆全國腦血管會(huì)議診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)過CT/MRI確診為腦卒中，患者存在一定的運(yùn)動(dòng)功能障礙，但生命特征平穩(wěn)。格拉斯哥昏迷評(píng)分＞8分，且為首次發(fā)病，首次發(fā)病后未見明顯功能障礙。動(dòng)脈粥樣硬化病例入選標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)左前降支，左回旋支，右冠狀動(dòng)脈中有至少1支內(nèi)徑狹窄超過50%。病例排除標(biāo)準(zhǔn):排除短暫性腦缺血發(fā)作、四肢癱瘓、病情惡化、蛛網(wǎng)膜下腔出血者、癡呆、合并嚴(yán)重肝腎心臟疾病、肌肉骨骼疾患、合并有活動(dòng)性肝病、充血性心力衰竭、惡性腫瘤、呼吸功能衰竭的嚴(yán)重疾病者。兩組患者年齡，性別等基線資料進(jìn)行比較結(jié)果顯示差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明兩組間具有可比性(P＞0.05)。

1.2 方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長度內(nèi)切法檢測(cè)患者ALOX5AP基因2354T/A與16699A/G多態(tài)性。神經(jīng)功能缺損評(píng)分(CNS)，F(xiàn)UGL-MEYER運(yùn)動(dòng)功能積分法(FMA)以及修訂巴氏指數(shù)(MBI)評(píng)價(jià)兩組患者的功能。運(yùn)動(dòng)功能:簡式Fugl-Meyer評(píng)分(FMA)。運(yùn)動(dòng)總分為100分，上肢運(yùn)動(dòng)最高分值66分，下肢運(yùn)動(dòng)最高分值34分。運(yùn)動(dòng)積分＜50分Ⅰ級(jí)，為嚴(yán)重運(yùn)動(dòng)障礙;50～84分為Ⅱ級(jí)，明顯運(yùn)動(dòng)功能障礙;85～95分為Ⅲ級(jí)，中度運(yùn)動(dòng)功能障礙;96～99分Ⅳ級(jí)，為輕度運(yùn)動(dòng)功能障礙。日常生活能力采用MBI。0～20分為極嚴(yán)重功能缺陷，25～45分嚴(yán)重功能缺陷，50～70分為中度功能缺陷，75～95分輕度功能缺陷。正常100分。ALOX5AP基因檢測(cè)方法:抽取兩組患者空腹12 h外周靜脈血，及時(shí)分離標(biāo)本，4 h內(nèi)完成測(cè)定。所有受試者于冠脈造影前動(dòng)脈鞘管采血5 ml裝入EDTA抗凝管中30 min內(nèi)離心，血漿血細(xì)胞分離。儲(chǔ)存于-70℃冰箱內(nèi)。3個(gè)月內(nèi)使用鹽析法提取全血基因組DNA。將抽血管血球帶倒入離心管后加溶液冰浴10 min，離心15 min，棄上清管內(nèi)沉淀吹勻，加蛋白酶K，37℃過夜，再于管內(nèi)加2.5 ml氯化鈉，至完全鹽析。離心15 min，去上清加氯仿混勻5 min，離心15 min吸出上清至50 ml離心管。上清液中加入無水乙醇，充分混勻DNA，挑出沉淀至1.5 ml離心管中，并加入75%乙醇洗兩遍，吸出乙醇溶液開蓋晾干，加入TE，于-70℃下保存。DNA提取后再進(jìn)行5-脂氧合酶基因的擴(kuò)增，限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切兩基因點(diǎn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料使用±s表示，計(jì)數(shù)資料采用率的形式，計(jì)量資料的兩組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者ALOX5AP基因頻率比較 ALOX5AP基因2354T/A，16699A/G于腦卒中合并動(dòng)脈粥樣硬化組中呈高表達(dá)，顯著高于單純腦卒中組(P＜0.05)。見表1。

2.2 兩組患者功能評(píng)分 腦卒中合并動(dòng)脈粥樣硬化患者的功能評(píng)分較單純腦卒中患者差(P＜0.05)。見表1。

表1 兩組ALOX5AP等位基因頻率及神經(jīng)功能評(píng)分(±s)

表1 兩組ALOX5AP等位基因頻率及神經(jīng)功能評(píng)分(±s)

與腦卒中組比較:1)P＜0.05

43 12.4 8.3 17.34±8.04 31.52±6.34 29.11±6.23合并動(dòng)脈粥樣硬化組 35 35.21) 24.81) 20.02±9.121) 27.53±6.671) 24.16±5.351)CNS MBI FMA單純腦卒中組組別 n 2354T/A等位基因頻率(%)16699A/G等位基因頻率(%)

3 討論

研究者在篩查5-LO抑制劑時(shí)發(fā)現(xiàn)了中性粒細(xì)胞中的白三烯合成的抑制劑，而MK-886于細(xì)胞裂解實(shí)驗(yàn)中顯示5-LO并無抑制作用，對(duì)于酶的提純也無明顯抑制作用，使用親和柱MK-886放射光親和類似物法證明在大鼠及人白細(xì)胞中MK-886的分子可以同18 kD膜蛋白結(jié)合〔2〕。Dixon等〔3〕用人骨肉瘤細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，在單獨(dú)表達(dá)5-LO時(shí)發(fā)現(xiàn)僅在5-LO和18 kD蛋白功能表達(dá)的培養(yǎng)細(xì)胞中才可以合成白三烯。由此提示18 kD蛋白對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的5-LO活性是必需的物質(zhì)，因此，將該類蛋白命名為花生四烯酸5-脂氧合酶激活蛋白。

5-脂氧合酶是白三烯類代謝產(chǎn)物生成的關(guān)鍵酶，它催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為5-氫過氧化二十碳四烯酸進(jìn)一步氧化成為白三烯，白三烯水化為白三烯B4或在其他酶類作用下催化生成LTC4參與炎性反應(yīng)。其中LTB4是潛在中性白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及其他炎癥細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)的化學(xué)誘導(dǎo)劑，它可以加速化學(xué)運(yùn)動(dòng)型增加血管內(nèi)皮黏附是高活性物質(zhì)。胱氨酰白三烯可以增加血管的通透性及平滑肌的收縮，它的多少也同支氣管和血管收縮、哮喘的發(fā)生有關(guān)〔4〕。5-脂氧合酶激活蛋白分子量為18 kD，其蛋白包含3個(gè)跨膜區(qū)與2個(gè)親水環(huán)，F(xiàn)LAP位于包膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上它是激活5-脂氧合酶活性所需。它是5脂氧合酶同膜的結(jié)合部位，除了可以參與5-脂氧合酶與膜的結(jié)合外也可以作為氨基酸合成蛋白的底物。

ALOX5AP基因于13號(hào)染色體 13Q12，基因長度約為31 kb，有5個(gè)較小的外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，該基因編碼區(qū)含有多核苷酸多態(tài)性，且其突變率較高，推測(cè)可能這些SNP中存在功能性突變，從而影響5-脂氧合酶激活蛋白的合成或影響其活性。既往有大量關(guān)于5-脂氧合酶激活蛋白調(diào)節(jié)5-脂氧合酶的活性，以及ALOX5AP基因變異對(duì)于5-脂氧合酶代謝途徑的影響。Helgado等〔5〕首先報(bào)道了ALOX5AP基因可以甲素白三烯的形成，刺激一些其他參與炎癥動(dòng)脈硬化的路徑，并且確認(rèn)ALOX5AP染色體的13q12-13位點(diǎn)可能是增加腦卒中患者發(fā)病危險(xiǎn)的重要因素。雖然關(guān)于ALOX5AP報(bào)道的研究很多，但其變異同動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)生發(fā)展仍然缺乏相關(guān)研究。Helgado等〔5〕進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ALOX5AP，2354AA基因增加的人群中會(huì)增加1.55倍腦梗死的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。但具體其同腦梗死發(fā)生的關(guān)聯(lián)機(jī)制并不明確。研究表明，F(xiàn)LAP/5-LO通道多于白細(xì)胞中表達(dá)，可以增加酶活性，促進(jìn)炎性因子白三烯的釋放，增強(qiáng)血管通透性及血管的收縮以及單核細(xì)胞，血管內(nèi)皮的黏附作用。如此，在斑塊的炎性損傷區(qū)域?qū)⒋嬖谝粋€(gè)惡性循環(huán)會(huì)增加血管損傷的風(fēng)險(xiǎn)性。ALOX5AP在多數(shù)研究中已經(jīng)被證實(shí)可以通過致動(dòng)脈粥樣硬化作用引發(fā)腦梗死，那么我們推測(cè)它在導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化作用的發(fā)病過程中也起到一定作用。

本研究提示ALOX5AP基因的多態(tài)性和腦卒中合并動(dòng)脈粥樣硬化患者的功能恢復(fù)具有一定的關(guān)聯(lián)，但本研究樣本量過少，相關(guān)的遺傳及環(huán)境也是影響試驗(yàn)結(jié)果的重要因素，還需要進(jìn)一步研究。

1 張偉麗，石 佳，楊曉敏，等.ALOX5AP基因多態(tài)2354T/A和MTHFR基因多態(tài)677C/T的協(xié)同作用顯著增加腦梗死的易患性〔J〕.中國分子心臟病學(xué)雜志，2005;5(1):395-400.

2 Ro M，Kim S，Pyun JA，et al.Association between arachidonate 5-lipoxygenase-activating protein(ALOX5AP)and lung function in a Korean population〔J〕.Scand J Immunol，2012;76(2):151-7.

3 Dixon WP，McNeish JD，Griffiths RJ，et al.Induction of hepatic microsomal drug-metabolizing enzymes by inhibitors of 5-lipoxygenase(5-LO):studies in rats and 5-LO knockout mice〔J〕.Toxicol Sci，2001;63(1):15-21.

4 高 強(qiáng)，楊春曉，慕璐巖，等.ALOX5AP基因突變與缺血性腦卒中的關(guān)系〔J〕.臨床神經(jīng)病學(xué)雜志，2007;20(5):326-8.

5 Helgado Lapenna A，Laxton RC，Ye S，et al.Comment on:a promoter polymorphism(rs17222919，-1316T/G)of ALOX5AP is associated with intracerebral hemorrhage in Korean population〔J〕.Prostagl Leukotr Essent Fatty Acids，2012;86(3):135-6.