二硫代氨基甲酸吡咯烷聯(lián)合卡鉑對(duì)U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響

王文新，邱建武

（遼寧醫(yī)學(xué)院附屬：1.研究生學(xué)院；2.第一醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧錦州121001）

核轉(zhuǎn)錄因子－κB（nuclear factor－kappa B，NF－κB）是一類廣泛存在于細(xì)胞中的多顯性核轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、凋亡關(guān)系密切，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［1］。異常的NF－κB活性在人類惡性膠質(zhì)瘤的局灶性壞死形成中至關(guān)重要，NF－κB活性的抑制或NF－κB調(diào)節(jié)基因被證明能促進(jìn)腦腫瘤生長、發(fā)病和血管轉(zhuǎn)移［2－3］。NF－κB的異 常 激 活 表 達(dá) 與 多 種 疾 病 的 發(fā) 生 有 關(guān)［4－5］。研究表明，多種抗腫瘤藥物能引起NF－κB的活化［6］。吡咯烷二硫代氨基甲酸（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）可抑制NF－κB的亞單位，并具有金屬螯合作用，是NF－κB特異性阻斷劑，可抑制其活性，具有多靶點(diǎn)高效的抗瘤作用。現(xiàn)將PDTC聯(lián)合卡鉑（carboplatin，CBP）對(duì)U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖與凋亡的影響報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，達(dá)氏修正依氏培養(yǎng)基（Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM），磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS），pH 7.2～7.4，10%胎牛血清（fetal bocine serum，F(xiàn)BS），四甲基偶氮唑藍(lán)（3－［4，5－dimethylthiazol－2－yl］－2，5diphenyl tetrazolium bromide，MTT），臺(tái)盼 藍(lán)染色，膜聯(lián)蛋白－V 型－異硫氰酸 熒光 素 （annexin－V－fluorescein isothiocyanate，annexin V－FITC）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙 染 色 試 劑 盒。PDTC，CBP，二 甲 基 亞 砜 （dimethyl sulfoxide，DMSO）。

1.2 方法

1.2.1 U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)與分組 U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞在100U／mL青霉素、100μg／mL鏈霉素和含有10%滅活FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃含5%CO2相對(duì)濕度95%的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞貼壁生長，每1天換液1次，2～3d以1∶3傳代1次，用0.125%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。將PDTC和CBP用無菌蒸餾水調(diào)整為20μg／mL，4℃冰箱避光冷藏。將傳代2次后的U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞隨機(jī)分4組，對(duì)照組加常規(guī)培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)A組加PDTC（0.1mg／mL）0.01mL，實(shí)驗(yàn)B組加 CBP（1mg／mL）0.01mL，實(shí)驗(yàn) C組加PDTC（0.1mg／mL）0.01mL和CBP（1mg／mL）0.01mL，置于37℃、5%CO2、相對(duì)濕度95%的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

表1 4組不同時(shí)間U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長抑制率和凋亡率比較（±s，%）

表1 4組不同時(shí)間U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長抑制率和凋亡率比較（±s，%）

＊：P＜0.05，與對(duì)照組比較；△：P＜0.05，與實(shí)驗(yàn)C組比較。

組別細(xì)胞抑制率12h 24h 36h細(xì)胞凋亡率對(duì)照組 4.28±0.021△ 9.34±0.023△ 13.86±0.025△ 0.80±0.300△實(shí)驗(yàn)A組 10.63±0.019＊△ 15.06±0.041＊△ 28.34±0.032＊△ 29.10±1.500＊△實(shí)驗(yàn)B組 24.16±0.025＊△ 33.71±0.053＊△ 39.42±0.041＊△ 38.70±3.200＊△實(shí)驗(yàn)C組 32.15±0.016＊ 40.82±0.046＊ 45.27±0.031＊ 61.30±2.700＊

圖1 顯微鏡下4組U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞形態(tài)（臺(tái)盼藍(lán)染色，×200）

1.2.2 U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖情況觀察 采用MTT法生長抑制率（CGIR），抑制率越低，表示細(xì)胞增殖越高。將各組細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為1×104／mL，加入96孔培養(yǎng)板中，每孔200μL，每組設(shè)3個(gè)平行孔。調(diào)零孔放對(duì)照組細(xì)胞懸液，對(duì)照孔分別放實(shí)驗(yàn)A、B、C組的細(xì)胞懸液。繼續(xù)分別培養(yǎng)12、24、36h，每孔加入20μL MTT溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h后，終止培養(yǎng)，小心吸盡孔內(nèi)上清液，每孔加入100μL DMSO，震蕩10 min，混勻后用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測490nm波長處各組細(xì)胞的光密度值（optical density，OD），抑制率＝1－實(shí)驗(yàn)組OD值／對(duì)照組OD值。

1.2.3 U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率測算 采用流式細(xì)胞儀檢測按對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)A、B、C組置孔，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，取各組細(xì)胞，將細(xì)胞收入10mL離心管中，1 500r／min離心3 min，PBS液漂洗離心1次，棄去上清液。100μL PBS液沖懸細(xì)胞，輕輕吹勻成單細(xì)胞懸液。annexin－V－FITC、PI各加入5 μL，室溫避光染色30min，用流式細(xì)胞儀檢測，取每組6個(gè)數(shù)值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得出每組細(xì)胞的凋亡率。

1.2.4 臺(tái)盼藍(lán)染色觀察 培養(yǎng)24h后從4個(gè)組中隨機(jī)各取1瓶培養(yǎng)瓶，用0.125%胰酶消化貼壁細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，并作適當(dāng)稀釋。然后將購買的成品0.4%臺(tái)盼藍(lán)與細(xì)胞懸液以1∶9混合混勻（終濃度0.04%）。接著在3min內(nèi)，倒置相關(guān)顯微鏡下觀察，死細(xì)胞被染成明顯的藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染呈無色透明狀。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

4組U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長抑制率和凋亡率見表1。臺(tái)盼藍(lán)染色在倒置相關(guān)顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)見圖1。

3 討 論

腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤來源于神經(jīng)上皮的腫瘤，是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，約占全部的顱內(nèi)腫瘤的40%～50%。預(yù)后差，尤其是惡性腫瘤，平均生存期不超過1年。目前治療方法主要以手術(shù)切除為主，但由于其具有腫瘤浸潤性生長的特點(diǎn)，難以完全切除，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，因此，常需要加以放療、化療及生物治療等輔助治療。NF－κB廣泛存在于機(jī)體細(xì)胞中，是一類能與多基因啟動(dòng)子部位的κB位點(diǎn)特異結(jié)合并促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的DNA結(jié)合蛋白總稱。在靜止細(xì)胞中，由于IκB蛋白與 NF－κB結(jié)合，使NF－κB以無活性狀態(tài)存在于胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，IκB蛋白可以被IκK激酶復(fù)合體磷酸化而導(dǎo)致降解，從而激活NF－κB，使NF－κB自由從胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，與核內(nèi)的靶序列結(jié)合，調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，控制細(xì)胞增殖、死亡和遷移。NF－κB作為轉(zhuǎn)錄因子，通過上調(diào)一些促生存基因如Bcl－x l、TRAF 1、TRAF2、SOD等或凋亡蛋白抑制物的水平或直接誘導(dǎo)抗凋亡基因而發(fā)揮抗凋亡作用，可阻止由腫瘤壞死因子和其他遺傳毒性作用等引起的細(xì)胞凋亡［7］。有研究顯示，以腫瘤壞死因子誘導(dǎo)NF－κB的表達(dá)使乳腺癌細(xì)胞對(duì)放化療的抵抗力增加，姜黃素通過抑制 NF－κB而誘導(dǎo)凋亡［8－9］。有研究表明，在健康人腦組織細(xì)胞中僅存在無活化的NF－κB的表達(dá)，而在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中則可以檢測到活化的 NF－κB蛋白［1］。Xiong等［10］研究發(fā)現(xiàn)，抑制前列腺癌細(xì)胞中NF－κB的活性，可下調(diào)血管生成因子VEGF和IL－8，減少腫瘤血管形成，從而限制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。最近，Lavon等［11］報(bào)道，在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中，NF－κB可以誘導(dǎo)O6－甲基鳥嘌呤－DNA甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞株對(duì)烷化劑耐藥。NF－κB在腫瘤細(xì)胞中有明確的抗凋亡作用，抑制NF－κB的表達(dá)可以增加腫瘤壞死因子引起的細(xì)胞凋亡及增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放療、化療的敏感性［12－13］。人們已逐漸認(rèn)識(shí)到NF－κB在腫瘤中所起的作用，NF－κB的抑制劑可成為惡性腫瘤治療潛在的靶點(diǎn)。亞硝脲類藥物是治療腦腫瘤的常用藥，CBP為第2代鉑類化合物，與順鉑同屬細(xì)胞周期非特異性藥物。由于抗腫瘤活性較強(qiáng)，消化道反應(yīng)及腎毒性較低，因而是臨床治療各種實(shí)體腫瘤的常用藥。其主要作用DNA的鳥嘌呤的N7和O6原子上，引起DNA鏈間和鏈內(nèi)交聯(lián)，破壞DNA分子，阻止其螺旋解鏈，干擾DNA合成，而產(chǎn)生細(xì)胞毒作用［14－15］。所以本實(shí)驗(yàn)選用NF－κB抑制劑PDTC聯(lián)合卡鉑作用U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PDTC聯(lián)合卡鉑治療組較單一組治療細(xì)胞抑制作用增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡率增高。這表明NF－κB抑制劑PDTC可以提高腫瘤細(xì)胞對(duì)卡鉑的敏感性，二者具有協(xié)同作用。其可能機(jī)制是NF－κB表達(dá)被特異性抑制后，NF－κB處于失活狀態(tài)，無法從胞質(zhì)自由進(jìn)入細(xì)胞核，與細(xì)胞核內(nèi)的靶序列結(jié)合，就不能調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄、控制細(xì)胞增殖、死亡、遷移。并且NF－κB抑制劑PDTC還能抑制MGMT蛋白的表達(dá)，降低細(xì)胞株對(duì)化療藥物的耐藥性。

因此，NF－κB抑制劑PDTC聯(lián)合卡鉑可以抑制U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。聯(lián)合NF－κB抑制劑PDTC可以提高卡鉑對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的化療效果，抑制NF－κB活化為神經(jīng)膠質(zhì)瘤化療提供靶向，以期延長患者生命。

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