趨化因子CXCL12/CXCR4軸與lgr5基因在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)

孫 艷 榮 容 張偉杰 曲榮鋒 金仙梅 夏大文 李玉林 遲寶榮(吉林大學(xué)第二醫(yī)院腫瘤血液內(nèi)科，吉林 長春 00)

隨著我國飲食習(xí)慣和結(jié)構(gòu)的改變以及人口老齡化，結(jié)直腸癌發(fā)病率及死亡率呈上升趨勢(shì)〔1〕，侵襲和轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌死亡的主要原因。近年研究表明CXC族趨化因子CXCL12，又稱基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF-1)，及其受體CXCR4在腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用〔2〕。富含亮氨酸重復(fù)單位的G蛋白偶聯(lián)受體5(lgr5)在小腸和結(jié)腸隱窩基底柱狀上皮細(xì)胞特異性表達(dá)，經(jīng)研究證實(shí)其為小腸和結(jié)直腸干細(xì)胞標(biāo)記物〔3，4〕。目前認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞(CSC)是腫瘤中具有自我更新能力并能產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞，為腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源〔5〕。因此本研究旨在探討人結(jié)直腸癌組織中趨化因子CXCL12/CXCR4生物軸及干細(xì)胞標(biāo)志物lgr5基因的表達(dá)變化及其與臨床病理特征間的關(guān)系，從而探尋新的抗腫瘤治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集2011年1月至2011年12月在吉林大學(xué)第二醫(yī)院基本外科行手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織及遠(yuǎn)端切緣部位正常組織標(biāo)本各27例，術(shù)前均未行化療、放療等輔助治療;取離體30 min內(nèi)的惡性腫瘤組織、遠(yuǎn)端切緣部位正常組織，分別切取成直徑為0.2～0.5 cm的組織塊3塊，迅速浸入預(yù)先放置RNAsafeguard保存試劑的滅菌凍存管中，再轉(zhuǎn)入－80℃超低溫冰箱保存。術(shù)后組織病理學(xué)確診，根據(jù)第7版《AJCC腫瘤分期手冊(cè)》，27例結(jié)直腸癌患者中Ⅰ期4例，ⅡA期6例，ⅢA期1例，ⅢB期8例，ⅢC期3例，ⅣA期3例，ⅣB期2例。

1.2 主要試劑和儀器 Trizol總RNA抽提試劑盒購自(德國QIGEN 公司)，PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix Ex TaqTM均購自(日本TAKARA公司)，人淋巴細(xì)胞分離液購自(天津TBD公司)，RNAsafeguard保存試劑購自(杭州博日公司)，ABI7500 Fast Real-Time熒光定量PCR儀購自(美國Applied Biosystems公司)。

1.3 總RNA提取和cDNA合成 取冷凍保存的組織標(biāo)本100～200 mg，參照試劑盒說明書步驟，采用Trizol法提取總RNA，對(duì)獲得的RNA采用紫外分光光度計(jì)測OD260和OD280值，按公式計(jì)算出RNA的濃度和純度。

取 1 μg總 RNA，加入5 × gDNA Eraser Buffer 2 μl，gDNA E-raser 1 μl，RNase Free dH2O 使總反應(yīng)體系為 10 μl，42℃ 2 min行基因組DNA的除去反應(yīng)。之后冰上配制反應(yīng)液，5×Prime-Script?Buffer 4 μl，PrimeScript?RT Enzyme Mix I 1 μl，RT Prim-er Mix 1 μl，基因組 DNA 除去后的反應(yīng)液 10 μl，加入 RNase Free dH2O 使總反應(yīng)體系為 20 μl，37℃ 15 min，85℃ 5 s，合成的cDNA －20℃保存待用。

1.4 SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR檢測CXCL12、CXCR4及l(fā)gr5 mRNA表達(dá) 參照PrimerBank數(shù)據(jù)，由博仕生物公司合成CXCL12、CXCR4、lgr5及內(nèi)參基因GAPDH引物，具體序列、產(chǎn)物大小及退火溫度如下，CXCL12基因:上游引物 5'-ACTGGGTTTGTGATTGCCTCTGAA-3'，下游引物 5'-GGAACCTGAACCCCTGCT GTG-3'，產(chǎn)物126 bp;CXCR4基因:上游引物:5'-CCTATGCAAGGCAGTCCATGT-3'，下游引物:5'-GGTAGCGGTCCAGACTGATGA-3'，產(chǎn)物86 bp;lgr5基因:上游引物5'-CACCTCCTACCTAGACCTCAGT-3'，下游引物:5'-CGCAAGACGTAACTCCTCCAG-3'，產(chǎn)物94 bp。內(nèi)參基因GAPDH:上游引物:5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'，下游引物:5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'，產(chǎn)物87 bp。退火溫度均為60℃。

取待測各樣品cDNA 2 μl，分別加入SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(2 ×)12.5 μl，擴(kuò)增基因上、下游引物(10 μmol/L)各 0.5 μl，ROX Reference Dye(50 × )0.5 μl，dH2O 9 μl，總反應(yīng)體系25 μl。除樣品管外，同時(shí)設(shè)置不加模板陰性對(duì)照管。將加樣管置于ABI7500FAST熒光定量PCR檢測槽內(nèi)，打開軟件，設(shè)定檢測程序?yàn)?Relative Quantification(ddCt)Plate，檢測熒光為SYBR。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，設(shè)置溶解曲線。每個(gè)cDNA樣本均重復(fù)檢測3次，無明顯差異的情況下取平均值。應(yīng)用Relative Quantification(ddCt)Study定量分析軟件采用 2-△△Ct法對(duì) CXCL12、CXCR4及 lgr5 mRNA表達(dá)行相對(duì)定量分析〔6〕。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用中位數(shù)(最小值，最大值)表示，CXCL12、CXCR4及l(fā)gr5 mRNA在不同組織間、臨床病理參數(shù)之間表達(dá)差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Wilcoxon、Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 RNA抽提結(jié)果 提取的RNA經(jīng)瓊脂糖電泳，紫外投射儀下觀察，18 s和28 s條帶完整、明亮，28 s寬度約為18 s的2倍，OD260/OD280平均為1.8～2.0，表示抽提的RNA純度較高。

2.2 CXCL12、CXCR4及l(fā)gr5 mRNA實(shí)時(shí)定量PCR表達(dá)結(jié)果

CXCL12、CXCR4、lgr5及內(nèi)參基因 GAPDH的 SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR產(chǎn)物顯示，熒光擴(kuò)增曲線呈平滑的S型曲線，溶解曲線分析呈單一峰無非特異性熒光，表明PCR產(chǎn)物無非特異性擴(kuò)增及DNA污染。

27例結(jié)直腸癌組織及27例匹配的遠(yuǎn)端切緣部位正常組織中均檢測到CXCL12、CXCR4、lgr5 mRNA表達(dá)，癌組織中CXCR4、lgr5 mRNA表達(dá)均明顯高于正常組織，但CXCL12 mRNA在癌組織中表達(dá)下調(diào)，癌組織中表達(dá)明顯低于匹配正常組織，兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表1。

2.3 結(jié)腸癌組織中CXCL12、CXCR4、lgr5 mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 27例結(jié)直腸癌患者中男性12例，女性15例。年齡≤60歲13例，＞60歲14例，平均年齡62歲。結(jié)腸癌11例，直腸癌16例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例。CXCL12、CXCR4、lgr5 mRNA在不同性別、年齡、腫瘤原發(fā)部位、大小、組織學(xué)類型組間表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。但有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組CXCR4、lgr5 mRNA表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組CXCL12 mRNA表達(dá)下降更顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表1 CXCL12、CXCR4、lgr5 mRNA在結(jié)直腸癌組織及匹配正常組織中的表達(dá)〔中位數(shù)(最小值，最大值)〕

表2 結(jié)直腸癌組織中CXCL12、CXCR4、lgr5 mRNA的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系〔中位數(shù)(最小值，最大值)〕

3 討論

新近《自然》和《科學(xué)》雜志同期發(fā)表的3項(xiàng)涉及腦、皮膚及腸道腫瘤的研究，首次在原生環(huán)境中確定CSC的存在〔7～9〕。其中Schepers等〔7〕在小鼠腸道腺瘤模型中，通過譜系追蹤技術(shù)證實(shí)，可標(biāo)記正常腸道腺窩干細(xì)胞的標(biāo)志物lgr5，也同時(shí)出現(xiàn)在腺瘤細(xì)胞的一個(gè)亞群中。研究表明此類細(xì)胞約占5% ～10%，位于腺瘤基底部，于潘氏細(xì)胞間雜分布，是驅(qū)動(dòng)腺瘤增長的關(guān)鍵。此項(xiàng)被稱之為“看見腫瘤干細(xì)胞”的研究為CSC作為治療靶點(diǎn)提供了確鑿的證據(jù)。

人類lgr5基因定位于染色體12q22～q23，在大腦、脊髓、乳腺、毛囊、生殖器官及胃腸道等均有表達(dá)。Wnt信號(hào)通路廣泛作用于機(jī)體生長發(fā)育過程，參與人體的胚胎發(fā)育、干細(xì)胞的增殖分化以及腫瘤的形成。lgr5作為Wnt信號(hào)通路中靶基因，當(dāng)信號(hào)通路異常激活時(shí)，引起lgr5的表達(dá)顯著升高，可能對(duì)腸上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化起到重要作用。而研究也表明lgr5是小腸和結(jié)直腸干細(xì)胞標(biāo)記物，推測如干細(xì)胞的Wnt信號(hào)通路異常激活后，引起靶基因lgr5的表達(dá)升高，可促進(jìn)干細(xì)胞的增殖分化和惡性轉(zhuǎn)化。

根據(jù)腫瘤細(xì)胞基于趨化因子實(shí)現(xiàn)器官特異性轉(zhuǎn)移的理論〔10〕，不同的腫瘤高表達(dá)特異的趨化因子受體，而有些器官高表達(dá)其相應(yīng)的趨化因子配體，腫瘤細(xì)胞利用趨化因子與其受體的特異性結(jié)合力，最終達(dá)成向這些器官的特異性轉(zhuǎn)移。趨化因子CXCL12與其特異性受體CXCR4所構(gòu)成的CXCL12/CXCR4生物學(xué)軸在多種腫瘤的播散和器官特異性轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用〔2〕。高表達(dá)CXCR4的腫瘤細(xì)胞，可能在CXCL12趨化、牽引下，轉(zhuǎn)移至作為配體產(chǎn)生源的某些器官，從而形成器官特異性轉(zhuǎn)移。

基于CSC是腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的種子細(xì)胞，以及CXCL12/CXCR4生物學(xué)軸在腫瘤的播散和器官特異性轉(zhuǎn)移中的重要作用。筆者推測結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中，如Wnt信號(hào)通路靶基因lgr5的表達(dá)升高，可促進(jìn)結(jié)直腸干細(xì)胞的增殖分化和惡性轉(zhuǎn)化，此后在趨化因子CXCL12與其特異性受體CXCR4所構(gòu)成的CXCL12/CXCR4生物學(xué)軸作用下，實(shí)現(xiàn)結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

因此在本研究中，筆者采用SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR檢測54例結(jié)直腸癌組織、匹配的遠(yuǎn)端切緣正常組織中CXCL12、CXCR4及l(fā)gr5 mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示癌組織中l(wèi)gr5、CXCR4在mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)明顯升高，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。而CXCL12 mRNA在癌組織中表達(dá)低于匹配正常組織。癌組織中CXCR4 mRNA表達(dá)上調(diào)及CXCL12 mRNA表達(dá)下調(diào)，可促使細(xì)胞定向遷移至趨化因子濃度較高的組織器官。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組CXCL12 mRNA表達(dá)下降更顯著，也佐證了CXCL12/CXCR4生物學(xué)軸在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的作用。

腫瘤干細(xì)胞具有的自我更新能力和分化潛能、高致瘤性、耐藥性等生物學(xué)特點(diǎn)，決定CSC是手術(shù)、放化療等傳統(tǒng)治療失敗的主要因素。常規(guī)的腫瘤治療方法對(duì)處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)的CSC起效甚微，反而藥物篩選、富集及殘存的CSC得以增殖，從而成為腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的種子細(xì)胞。通過揭示CSC表面標(biāo)記物，CSC中突變基因或異常信號(hào)傳導(dǎo)途徑等潛在治療靶點(diǎn)，方能更有效地靶向CSC〔11〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示癌組織中 lgr5在mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)明顯升高，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞參與腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移。趨化因子CXCL12與其特異性受體CXCR4所構(gòu)成的CXCL12/CXCR4生物學(xué)軸在多種腫瘤的局部侵襲和器官特異性轉(zhuǎn)移中的作用也得以證實(shí)。因此通過CSC生物學(xué)性狀的揭示，CXCL12/CXCR4生物軸在腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移調(diào)控機(jī)制的進(jìn)一步研究，預(yù)測CXCL12/CXCR4、lgr5有望成為抗腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

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