何首烏二苯乙烯苷對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元L型鈣離子通道的影響

朱秋雙 任春清 包利澤 趙錦程 劉 蕾 白 雪 楊 玉 劉明遠(yuǎn)

(佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

腦組織細(xì)胞鈣離子內(nèi)流增加，能啟動(dòng)細(xì)胞凋亡通路，是阿爾茨海默病(AD)發(fā)病機(jī)制之一〔1〕。隨著中國(guó)不可逆轉(zhuǎn)的進(jìn)入老齡化社會(huì)，AD已經(jīng)成為影響我國(guó)人口健康和生活質(zhì)量的公共健康問(wèn)題，開(kāi)發(fā)研究確實(shí)有效的預(yù)防治療藥物非常迫切。何首烏(Polygonum Multiflorum Thunb)據(jù)《本草綱目》記載有“益精髓、延年不老”之效。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，何首烏對(duì)大鼠的學(xué)習(xí)記憶有保護(hù)作用，且能抑制海馬細(xì)胞凋亡〔2〕。二苯乙烯苷(TSG)是何首烏的主要有效成分。本研究利用膜片鉗技術(shù)研究TSG對(duì)海馬L型鈣離子通道的影響，試圖從離子通道水平解釋何首烏對(duì)AD影響的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康Wistar大鼠〔購(gòu)自長(zhǎng)春高新醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，合格證號(hào):SCXK-(吉)2003-0004)〕，體重200 g左右。

1.2 主要試劑與儀器 NVSLM1型振動(dòng)切片機(jī)(Campden，英國(guó));電極拉制儀(P-97，美國(guó));倒置相差顯微鏡(Nikon，日本);膜片鉗系統(tǒng)(Axon，美國(guó));Pronase E(Sigma公司，美國(guó));Axopatch200-A放大器(Axon InstrumentsCA，美國(guó));Aβ1-40(Sigma公司，美國(guó));TSG(黑龍江省藥材公司)。

1.3 溶液 人工腦脊液(ACSF，mmol/L):NaCl 124，KCl 3，CaCl22，MgCl22，NaH2PO41.23，NaHCO326和 Glucose 10;切片液(mmol/L):KCl 2.5，NaH2PO41.25，MgCl26，CaCl21，sucrose 220，NaHCO326，Glucose 10。在電流鉗模式下，記錄鈣電流的電極內(nèi)液(mmol/L):K2SO460，NMG 60，HEPES 40，MgCl24，BAPTA 0.5，Phosphocreatine 12，Na2ATP 2，Na3GTP 0.2，用KOH將pH值調(diào)至7.2。在電壓鉗模式，記錄鈣電流的電極內(nèi)液(mmol/L):KCl 140、MgCl20.5、EGTA 2、HEPES 5、K2ATP;記錄電壓依賴性鈣電流的細(xì)胞外液(mmol/L):NaCl 150，KCl 5，MgCl21.1，CaCl22.5，HEPES 10，Glucose 10，TTX 0.001，用NaOH調(diào)pH為7.4。

1.4 方法

1.4.1 海馬錐體神經(jīng)元的制備 取200 g左右的Wistar大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射，待麻醉生效后，剪開(kāi)胸腔，暴露心臟，夾閉下腔靜脈，使用0℃切片液進(jìn)行心臟灌注。待灌流液體顏色較淡結(jié)束灌注，斷頭，取出全腦，置入0℃切片液(提前30 min經(jīng)95%O2+5%CO2混合氣飽和)中冰鎮(zhèn)3 min，分離出海馬，以350 μm 的厚度進(jìn)行切片〔3，4〕。將腦片移入 37℃ 水浴槽中待用的ACSF(提前30 h經(jīng)混合氣飽和)中孵育1 h，轉(zhuǎn)入23℃ACSF(經(jīng)混合氣飽和)中繼續(xù)孵育30 min后將腦片移入含6.0～7.0 U/ml的Pronase E的細(xì)胞外液中。32℃酶解25 min后用細(xì)胞外液清洗腦片6次以上，然后移入室溫細(xì)胞外液孵育備用。在整個(gè)過(guò)程中持續(xù)通氧氣。取腦片分離出CA1區(qū)，移入盛有氧飽和的細(xì)胞外液的離心管內(nèi)，用滴管輕輕吹打，將離心管豎直靜置，吸取上部細(xì)胞懸液，加入含有細(xì)胞外液的灌流槽中。約30 min后細(xì)胞貼壁，即可進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 全細(xì)胞膜片鉗電生理記錄TSG對(duì)海馬L型鈣離子通道(ICa-L)的影響 將新鮮分離的海馬神經(jīng)元放置于倒置顯微鏡上的灌流槽中，在室溫(23℃)下應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄單細(xì)胞離子電流。記錄電極經(jīng)P97微電極拉制儀拉制，尖端直徑1～2 μm，充灌電極內(nèi)液后電阻 2～4 MΩ，電極內(nèi)液使用0.2 μm的微孔濾膜濾過(guò)后充灌電極。采用傳統(tǒng)的全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄，抽吸破膜即可形成全細(xì)胞記錄。記錄電壓依賴性鈣電流采用階梯波給予刺激，鉗制電壓設(shè)置為－80 mV，持續(xù)50 ms;去極化到－40 mV，持續(xù)200 ms使鈉電流失活，超極化到－45 mV，10 ms后再去極化達(dá)到測(cè)試電壓0 mV，持續(xù)200 ms，頻率為0.2 Hz。記錄I-V曲線時(shí)鉗制電壓為－40 mV，以10 mV的步階脈沖去極化至+40 mV，持續(xù)200 ms。實(shí)驗(yàn)過(guò)程由計(jì)算機(jī)軟件pCLAMP9.2(Axon Instrument)控制數(shù)-模轉(zhuǎn)換器完成刺激信號(hào)的產(chǎn)生、反饋信號(hào)的采集以及數(shù)據(jù)分析。

分別以2.0和6.0 μmol/L TSG灌流給藥，觀察不同濃度的TSG對(duì)神經(jīng)元 ICa-L的影響。使用 Aβ1～40后分別使用2.0和6.0 μmol/L TSG觀察不同濃度的 TSG對(duì) L型鈣電流/電壓(I-V)曲線的影響。實(shí)驗(yàn)信號(hào)采集頻率:10 kHz。濾波頻率:2 kHz。

2 結(jié)果

2.1 TSG對(duì)ICa-L的影響 采用保持電位－40 mV，指令電壓－40至+60 mV，鉗制時(shí)間200 ms，階躍10 mV的刺激程序引出ICa-L，并且記錄30 min內(nèi)“rundown”現(xiàn)象，得出在12 min內(nèi)衰減明顯，所有的電流記錄均在電流穩(wěn)定后進(jìn)行。灌流給藥2.0及6.0 μmol/L TSG后5 min藥效穩(wěn)定。結(jié)果顯示不同濃度的TSG對(duì)神經(jīng)元ICa-L的影響不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度的TSG對(duì)ICa-L的影響(± s，n=10)

表1 不同濃度的TSG對(duì)ICa-L的影響(± s，n=10)

組別 給藥前 給藥后 P值2.0 μmol/L 16.75±0.83 15.25±1.03 ＞0.05 6.0 μmol/L 17.02±0.69 16.38±1.15 ＞0.05

2.2 TSG對(duì)ICa-L/電壓(I-V)曲線的影響 在電壓鉗方式下保持電位－40 mV，施予200 ms，階躍10 mV，－40至+60 mV的系列去極化脈沖，可引出ICa-L。細(xì)胞外給予1 μmol/L的Aβ，待穩(wěn)定以后，再給予2.0、6.0 μmol/L的 TSG，增大的 ICa-L峰值分別降低(37.27±3.65)%、(70.09±1.97)%，以各脈沖下電流密度(pA/pF)幅值對(duì)相應(yīng)測(cè)試電壓作圖得I-V曲線，將各細(xì)胞給藥前后I-V曲線的最大激活電壓進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果正常對(duì)照組細(xì)胞的最大激活電壓為0 mV，給藥后各測(cè)試電壓水平ICa-L減小，I-V曲線上移，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度TSG對(duì)I-V曲線的影響

3 討論

AD是在老年人衰老退化基礎(chǔ)上發(fā)生的癡呆，其病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不十分清楚。目前認(rèn)為神經(jīng)毒性物質(zhì)Aβ在腦中廣泛沉積在原發(fā)性癡呆發(fā)病中起中心作用，能引發(fā)神經(jīng)元退化和凋亡等諸多病理過(guò)程，最后引起癡呆〔5〕。海馬錐體神經(jīng)元是海馬區(qū)的主要成分，主要功能是參與近期記憶、情緒及內(nèi)臟功能調(diào)節(jié)，是老年性癡呆、癲癇等疾病的主要病灶之一。本課題研究小組實(shí)驗(yàn)研究表明何首烏硫浸膏對(duì)Aβ1～40注入大鼠右側(cè)海馬致AD模型小鼠的分辨學(xué)習(xí)及記憶保持能力有極大提高，對(duì)海馬細(xì)胞有保護(hù)作用，其具體機(jī)制不明確。是否對(duì)腦細(xì)胞離子通道有影響鮮有報(bào)道。

何首烏含有二苯乙烯苷、蒽醌類、磷脂類、糖類、多種氨基酸、多種維生素及微量元素，具有降血脂、抗衰老、增強(qiáng)免疫功能等作用〔6〕。TSG是何首烏降血脂的主要有效成分?！吨袊?guó)藥典》2005年版一部規(guī)定何首烏藥材中TSG不得少于1.0%。海馬神經(jīng)元上分布有L-型、T-型、N-型等多種鈣離子通道，其中L型電壓門(mén)控鈣通道廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，參與鈣穩(wěn)態(tài)、突觸可塑性、基因表達(dá)、激素分泌等多種細(xì)胞功能的調(diào)控，其過(guò)度激活與神經(jīng)退行性疾病、腦缺血、腦腫瘤等的病理過(guò)程有著密切的關(guān)系。本研究利用膜片鉗技術(shù)研究不同濃度TSG對(duì)未處理以及Aβ預(yù)處理的海馬神經(jīng)元的ICa-L的影響，結(jié)果顯示不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示TSG對(duì)海馬神經(jīng)元的ICa-L通道不具有影響作用。

淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說(shuō)一直占有AD發(fā)病機(jī)制的主要地位，Arispe在海馬神經(jīng)元細(xì)胞中加入Aβ觀察〔Ca2+〕i變化，結(jié)果大部分細(xì)胞〔Ca2+〕i都有明顯提高，而且 Aβ濃度增大，〔Ca2+〕i提高越多，呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。鈣通道阻斷劑的存在并不影響Aβ引發(fā)的〔Ca2+〕i升高，而Aβ抗體能顯著降低Aβ引發(fā)的〔Ca2+〕i升高，說(shuō)明〔Ca2+〕i的升高不是通過(guò)鈣通道流入的，而是通過(guò) Aβ在膜上形成的通道進(jìn)入細(xì)胞，引起〔Ca2+〕i超載〔7〕。因此，何首烏及其有效成分對(duì)AD的作用及機(jī)制，何首烏中有效成分TSG影響海馬細(xì)胞內(nèi)離子濃度方面的作用有待進(jìn)一步研究。

1 趙保路，萬(wàn) 莉.金屬離子代謝平衡失調(diào)與阿爾茨海默病早期發(fā)病機(jī)制〔J〕.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2012;39(8):756-63.

2 朱秋雙，任春清，包利澤，等.何首烏對(duì)阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用〔J〕.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2011;34(3):8.

3 Huang CS，Shi SH，Ule J，et al.Common molecular pathways mediate long-term potentiation of synaptic excitation and slow synaptic inhibition〔J〕.Cell，2005;123(1):105-18.

4 Xu ZC，Chen HSH.Preliminary study of application of patch clamp technique in adult rat hippocampal slices〔J〕.J Chongqing Med Univ，2012;37(9):799-801.

5 Giovannel L，Gasamenti F，Scall C，et al.Differential effect of amyloid peptide Aβ1-40 injection into the rat nucleus basalis〔J〕.Neuroscience，1995;66(6):781-2.

6 姚桂根，孫小萍，鄧星航.用醋酸鎂-甲醇比色法測(cè)定何首烏及其制劑中蒽醌類成分的含量〔J〕.中草藥，1983;14(6):8-15.

7 Arispe N，Rojas E，Pollard HB.Giant multilevel cation channels formed by Alzheimer disease amyloid beta-protein A beta(1-40)in bilayer membranes〔J〕.Proc Natl Acad Sic USA，1993;90(5):567-71.