柞蠶絲素蛋白-羥基磷灰石-BMSCs組織工程化骨修復(fù)老齡動(dòng)物骨缺損

張繼波 楊依勇 孔令菊 裴 丹 姚素艷 鄭德宇 (遼寧醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，遼寧 錦州 00)

現(xiàn)代骨修復(fù)技術(shù)主要有自體骨移植、異體(同種或異種)骨移植和人工骨材料移植。作為治療骨缺損金標(biāo)準(zhǔn)的自體骨移植和標(biāo)準(zhǔn)方法的同種異體骨移植〔1～6〕，因其缺點(diǎn)如自體骨移植的骨來(lái)源有限、量不足、副損傷大、供區(qū)感染等，異體骨移植可傳播疾病、免疫排斥反應(yīng)、倫理等問(wèn)題，導(dǎo)致兩種骨移植方法受到限制。人工骨對(duì)于修復(fù)骨缺損的價(jià)值逐漸顯現(xiàn)，但良好的人工骨材料應(yīng)滿足以下特點(diǎn):①無(wú)毒;②具有一定的機(jī)械強(qiáng)度;③良好的生物相容性;④生物降解性和降解速率與骨修復(fù)速率匹配等。單一的材料不足以滿足上述要求，故研制復(fù)合型生物活性支架材料是21世紀(jì)人工骨研究面臨的挑戰(zhàn)〔7〕。本實(shí)驗(yàn)將柞蠶絲素蛋白-羥基磷灰石(TSF-HA)與兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)復(fù)合構(gòu)建新的組織工程骨，用于修復(fù)老齡兔橈骨缺損，探討此種新型植骨材料的骨缺損修復(fù)作用，希望為臨床治療骨缺損提供一種新的人工骨材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 成骨誘導(dǎo)劑:β-甘油磷酸鈉(美國(guó)Sigma公司)、地塞米松(美國(guó)Sigma公司)、L-抗壞血酸(美國(guó)Sigma公司)。條件培養(yǎng)液:DMEM培養(yǎng)液中加入成骨誘導(dǎo)劑，構(gòu)成條件培養(yǎng)液。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 將TSF-HA復(fù)合材料制成1.5 cm×0.3 cm×0.3 cm長(zhǎng)方體，與兔橈骨的粗細(xì)形狀相近似，包裝后經(jīng)60Co消毒備用，該材料由遼寧醫(yī)學(xué)院解剖教研室鄭德宇和楊依勇提供。TSF-HA參數(shù)為:空隙率66%，平均孔徑80 μm，表觀密度0.76 g/cm3，壓縮強(qiáng)度10.1 MPa。新西蘭大耳白兔，12月齡，體質(zhì)量1 800～2 000 g，雌雄不限(由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 BMSCs的分離、培養(yǎng)及其成骨誘導(dǎo) 取出生24 h的乳兔，斷頸處死，將其浸泡入75%酒精中20 min，無(wú)菌分離四肢骨，放入含雙抗(青霉素200 U/ml、鏈霉素200 mg/ml)的 PBS緩沖液內(nèi)，沖洗2次。更換培養(yǎng)皿，快速清除骨膜等結(jié)締組織，剪去兩端骨骺，注射器吸取完全培養(yǎng)基(DMEM，10%FBS，青霉素100 U/ml，鏈霉素100 mg/ml)沖洗骨髓腔。將沖洗液離心(1 000 r/min，10 min)，棄上清液，吹打管反復(fù)吹打底部細(xì)胞。加入完全培養(yǎng)液，按1×106/ml的密度接種于25 ml培養(yǎng)瓶中，置于37℃，50 ml/L CO2飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。48 h后換液，以后每隔2～3 d換液1次。待細(xì)胞達(dá)80% ～90%融合后，0.25%胰酶消化，1∶3傳代分瓶培養(yǎng)，記為P1。細(xì)胞生長(zhǎng)再次鋪滿瓶底匯合時(shí)消化傳代，記為P2。取P2代BMSCs，加入條件DMEM培養(yǎng)液，每隔3 d換液，進(jìn)行成骨方向的定向誘導(dǎo)培養(yǎng)。待培養(yǎng)皿內(nèi)單層細(xì)胞生長(zhǎng)近匯合時(shí)消化傳代，記為P3。繼續(xù)使用條件培養(yǎng)液培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 材料與細(xì)胞共培養(yǎng) 無(wú)菌條件下將已滅菌的TSF-HA復(fù)合支架材料置入裝有條件培養(yǎng)液培養(yǎng)皿中浸泡24 h預(yù)濕，紫外線照射下自然晾干。將經(jīng)過(guò)條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)后生長(zhǎng)良好的第3代BMSCs消化、離心，以5×107/ml密度均勻滴加在預(yù)濕的支架材料上，接種后靜置于37℃、體積百分比為5%CO2和100%濕度孵箱中培養(yǎng)4～6 h;然后加入條件培養(yǎng)液完全覆蓋復(fù)合物，繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d備用。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及兔橈骨缺損模型的建立 新西蘭老齡大耳白兔共54只(隨機(jī)分3組:A、B、C組各18只)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，予質(zhì)量百分比為10%的水合氯醛耳緣靜脈+腹腔各半量麻醉生效后，無(wú)菌操作下，于左前臂內(nèi)側(cè)中上段縱行約3 cm直切口，切開(kāi)皮膚、皮下組織及深筋膜，沿肌間隙進(jìn)入，充分暴露橈骨中下段，用牙科鉆將長(zhǎng)15 mm橈骨連同骨膜一并截除，造成節(jié)段性骨缺損。A組植入TSF-HA+BMSCs復(fù)合物，B組單純植入TSF/HA，C組骨缺損區(qū)不植入任何材料?？p合皮下組織及皮膚，再次安爾碘消毒切口，患肢不行內(nèi)外固定。術(shù)前肌肉注射青霉素20萬(wàn) U/d，術(shù)后再次肌肉注射青霉素20萬(wàn)U/d，連續(xù)3 d，常規(guī)喂養(yǎng)。

1.2.4 觀察指標(biāo) (1)觀察術(shù)后老齡日本大耳白兔活動(dòng)、進(jìn)食、傷口愈合情況。(2)分別于術(shù)后8、12 w，每次隨機(jī)選取6只兔麻醉后攝前肢正位X線片，觀察各組橈骨缺損的骨修復(fù)程度;然后在麻醉狀態(tài)下注入空氣處死，取標(biāo)本行肉眼觀察及HE染色組織學(xué)觀察骨缺損的修復(fù)水平。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及TSF-HA-BMSCs復(fù)合物的構(gòu)建 原代培養(yǎng)的BMSCs呈長(zhǎng)梭形或多角形，經(jīng)成骨誘導(dǎo)后大約85%的細(xì)胞ALP染色呈陽(yáng)性，說(shuō)明細(xì)胞具有了骨系細(xì)胞的特點(diǎn)。誘導(dǎo)后的BMSCs與材料復(fù)合培養(yǎng)3 d后，可見(jiàn)細(xì)胞在材料表面生長(zhǎng)狀態(tài)良好，伸出偽足，并與材料緊密相貼。說(shuō)明構(gòu)建出了TSF-HA-BMSCs復(fù)合植骨材料(圖1)。

圖1 TSF/HA/BMSCs材料的構(gòu)建

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物觀察 術(shù)后動(dòng)物體溫、飲食正常，外界環(huán)境刺激敏感，切口無(wú)紅腫、滲液等炎性反應(yīng)。

2.3 影像學(xué)檢查 4 w時(shí)復(fù)合支架組骨折端與支架開(kāi)始交錯(cuò)，支架邊緣隱約可見(jiàn)少量骨痂;單純材料組清晰可見(jiàn)骨折端與支架間隙，未見(jiàn)明顯骨痂形成。8 w時(shí)復(fù)合支架組骨折端與支架連接，支架降解，被大量骨痂覆蓋;單純支架組骨折端與支架間隙模糊，支架周?chē)梢?jiàn)骨痂。12 w時(shí)復(fù)合材料組支架已基本被骨痂取代，骨密度較高，骨髓腔形成;單純支架組可見(jiàn)部分支架，并與骨折端結(jié)合緊密，骨密度也增高;空白組骨折缺損處見(jiàn)有瘢痕愈合，由周?chē)浗M織填充，未見(jiàn)明顯新生骨，趨向骨不連(圖2)。

由圖中可見(jiàn)8 w時(shí)實(shí)驗(yàn)組支架與骨折處緊密相連出現(xiàn)大量骨痂圍繞支架;對(duì)照組支架與骨痂雖相連，但仍有一定的間隙。12 w時(shí)實(shí)驗(yàn)組支架大部分被吸收，骨密度增高，骨修復(fù)良好;對(duì)照組骨痂增多，但仍可見(jiàn)部分支架;空白組骨缺損幾乎沒(méi)有骨修復(fù)現(xiàn)象，被周?chē)Y(jié)締組織填充。

圖2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的X線攝片

2.4 大體觀察 各組植入的支架材料在骨創(chuàng)區(qū)無(wú)移位，材料的周?chē)M織未見(jiàn)變性、壞死、化膿、積液等不良跡象。(1)8 w時(shí)，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)骨質(zhì)較薄的骨痂樣硬組織，標(biāo)本表面較為光滑，漸變暗紅色，表面見(jiàn)少量支架;對(duì)照組材料周?chē)伾凶兗t趨勢(shì)，支架開(kāi)始降解。(2)12 w時(shí)，實(shí)驗(yàn)組骨創(chuàng)區(qū)呈現(xiàn)乳白色，可見(jiàn)血管，新生出皮質(zhì)骨與骨折端皮質(zhì)連續(xù)，骨修復(fù)完成;對(duì)照組仍有部分支架露出骨外，與骨痂相連，骨修復(fù)部分完成;空白對(duì)照組骨缺損區(qū)被周?chē)Y(jié)締組織覆蓋，未見(jiàn)明顯骨痂。

2.5 組織學(xué)檢查 4 w時(shí)鏡下見(jiàn)A組有大量成纖維骨痂及少量成骨細(xì)胞，材料開(kāi)始被降解;B組骨創(chuàng)區(qū)有少量纖維骨痂形成。8 w時(shí)A組出現(xiàn)大量較成熟的骨組織結(jié)構(gòu)，周邊可見(jiàn)成骨細(xì)胞，類(lèi)似骨單位結(jié)構(gòu);B組支架開(kāi)始降解，缺損區(qū)見(jiàn)大量纖維組織增生，邊緣少量成骨細(xì)胞。12 w時(shí)，A組新生骨改建完成，材料周?chē)?jiàn)大量成熟的新生骨組織;B組出現(xiàn)新生骨組織，缺損區(qū)仍有部分纖維組織;C組缺損區(qū)見(jiàn)大量致密結(jié)締組織(圖3)。12 w時(shí)實(shí)驗(yàn)組支架幾乎完全被降解，周?chē)霈F(xiàn)大量骨組織，對(duì)照組新生成骨細(xì)胞較實(shí)驗(yàn)組少，空白組見(jiàn)大量纖維結(jié)締組織。

圖3 12 w時(shí)各組組織學(xué)變化(HE染色，×400)

3 討論

我國(guó)上世紀(jì)80年代四川大學(xué)和武漢工業(yè)大學(xué)等根據(jù)人體骨無(wú)機(jī)成分的主要成分羥基磷灰石(HA)，先后研制出了HA支架材料，作為人體硬組織修復(fù)和替代組織工程材料，并很快應(yīng)用于臨床。但因HA質(zhì)脆、吸收性差、不易降解等導(dǎo)致臨床使用受到限制〔8〕。絲素蛋白是從天然蠶絲中提取出的天然纖維蛋白，具有獨(dú)特機(jī)械特性和生物相容性，類(lèi)似骨組織中的膠原，具有膠原的一些特性，但SF膜在體內(nèi)引起的炎癥反應(yīng)要小于膠原蛋白膜〔9〕。通過(guò)RGD多肽表面修飾的絲素蛋白支架材料，能明顯促進(jìn)BMSCs在支架材料上黏附和鋪展，但對(duì)細(xì)胞增殖作用不明顯〔10〕。柞蠶絲蛋白不但具有家蠶絲素蛋白的特性，而且還含有大量的 Arg-Gly-Asp(精氨酸-乙氨酸-天門(mén)冬氨酸，RGD)三肽序列。RGD序列作為細(xì)胞膜整合素受體與細(xì)胞外配體相結(jié)合的識(shí)別位點(diǎn)，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞之間的相互作用，能夠促進(jìn)支架對(duì)細(xì)胞的黏附和伸展，利用細(xì)胞間信息傳遞。將羥基磷灰石多孔支架材料浸泡在柞蠶絲素蛋白的水溶液中，采取冷凍干燥制備的方法，進(jìn)行羥基磷灰石支架表面修飾，制備的TSF-HA復(fù)合多孔支架材料達(dá)到優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的作用，并且材料價(jià)格低廉，制備工藝簡(jiǎn)單。

研究結(jié)果顯示，TSF-HA復(fù)合支架材料構(gòu)建的組織工程化骨有很好的成骨作用，與宿主骨直接鍵合〔11〕。放射學(xué)和組織學(xué)評(píng)分結(jié)果顯示，15 mm的骨缺損在12 w左右能完全被TSFHA組織工程骨所替代和修復(fù)，骨皮質(zhì)橋連接和髓腔相通，支架材料降解完畢。這表明BMSCs被支架載入體內(nèi)后，細(xì)胞能在支架上繼續(xù)生長(zhǎng)、繁殖、分化，并發(fā)揮了成骨活性，說(shuō)明TSF-HA無(wú)毒、具有良好的組織相容性和成骨作用，能作為治療骨缺損的骨組織工程支架材料。

組織工程支架材料的吸水率及降解性吸水率是評(píng)價(jià)支架材料化學(xué)性質(zhì)和自身結(jié)構(gòu)的一個(gè)綜合指標(biāo)。它既反映了支架的有效孔隙率，又反映了支架本身的親疏水性及降解性。羥基磷灰石的降解吸收分主動(dòng)和被動(dòng)兩種方式。被動(dòng)吸收主要是指支架的孔徑、孔隙率，其孔隙率越大，吸水性也越大，降解速率也越快〔12〕;主動(dòng)吸收則與成骨細(xì)胞活性有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道，最有利于成骨細(xì)胞滲入到內(nèi)部的孔徑要大于40 μm，孔隙率達(dá)到70%;當(dāng)孔徑在150 μm，孔隙率大于30%能為骨組織長(zhǎng)入提供理想的場(chǎng)所〔13〕。筆者制作的TSF-HA支架，無(wú)論是孔徑大小，還是孔隙率與HA支架都相差無(wú)幾，基本符合以上標(biāo)準(zhǔn)。雖然兩種材料孔隙率、孔徑大小基本相同，但TSF-HA支架孔隙壁上吸附大量絲素蛋白顆粒，絲素蛋白作用于HA表面，與成骨細(xì)胞產(chǎn)生良好的親活性，加大細(xì)胞的黏附、細(xì)胞間信號(hào)的聯(lián)系促進(jìn)成骨細(xì)胞的生長(zhǎng);同時(shí)絲素蛋白具有良好的親水性，羥基磷灰石吸水性增加促使羥基磷灰石鈣離子析出，從而誘導(dǎo)羥基磷灰石形成晶體狀結(jié)構(gòu)。結(jié)晶隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，絲素蛋白的增多而不斷增加，尤其這些結(jié)晶的結(jié)構(gòu)、形態(tài)和人骨組織中的納米微晶非常相似〔14〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:12 w左右TSF-HA組織工程化骨完成了對(duì)骨缺損的修復(fù)，與易誠(chéng)青等〔15〕的研究結(jié)果相符，降解率適宜，作為骨缺損的爬行替代材料組織工程化骨可較快被自身骨組織取代，完成骨修復(fù)，基本符合現(xiàn)代骨組織工程學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)。TSF-HA組織工程化骨克服了單純HA降解極差的不足，顯示了TSF-HA作為理想人工骨的良好前景，有望成為一種新的、優(yōu)良的骨組織工程支架材料。對(duì)于TSF如何改變HA的理化性能、復(fù)合支架與BMSCs間和細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用，成骨等機(jī)制還不十分清楚，這些問(wèn)題有待于進(jìn)一步研究。

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