Gadd45a在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)及其與細(xì)胞凋亡及增殖的關(guān)系

冀秀英 王艷梅 白 洋 梁麗梅 (吉林省精神神經(jīng)病醫(yī)院，吉林 四平 6000)

腦膠質(zhì)瘤是由于大腦和脊髓膠質(zhì)細(xì)胞癌變所產(chǎn)生的、最常見(jiàn)的原發(fā)性顱腦腫瘤。如同其他腫瘤(疾病)一樣，膠質(zhì)瘤也是由于先天的遺傳高危因素和環(huán)境的致癌因素相互作用所導(dǎo)致的。Gadd45a細(xì)胞受到輻射等外界因素刺激DNA受到損傷后而表達(dá)的基因，Gadd45a基因高表達(dá)后可以通過(guò)阻滯細(xì)胞周期在G2-M期、修復(fù)DNA、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等保留大部分細(xì)胞的存活，而減少細(xì)胞癌變的可能。目前研究表明，Gadd45a基因異常表達(dá)與乳腺癌、胰腺癌、肺癌及前列腺癌密切相關(guān)〔1～5〕。本文探討Gadd45a在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)及其與細(xì)胞凋亡及增殖的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251細(xì)胞購(gòu)自上?？婆d生物科技有限公司;正常腦組織來(lái)自我院神經(jīng)外科手術(shù)切除組織;胎牛血清、annexinⅤ、PI、MTT試劑購(gòu)自 Hyclone公司;M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Promega公司;流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 腦組織制備單細(xì)胞懸液的方法 將大腦組織置于事先消毒好的200目細(xì)胞篩(下接容器)，用玻璃棒輕輕研磨腦組織，使其變成單個(gè)細(xì)胞，待研碎后用生理鹽水或培養(yǎng)液沖洗，細(xì)胞篩下容器內(nèi)所盛溶液為單細(xì)胞懸液。用吸管吹打均勻后離心，1 000 r/min，5 min，傾出上清，如此沖洗1～2次后加生理鹽水或培養(yǎng)液，制成單個(gè)腦細(xì)胞懸液，用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 RT-PCR方法檢測(cè)Gadd45a mRNA在細(xì)胞中的表達(dá)根據(jù)RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取正常腦組織神經(jīng)細(xì)胞和U251細(xì)胞中的總RNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。選擇GAPDH作為內(nèi)參照。Gadd45a上游引物:5'TTACATTGGCAAGTT3'，下游引物:5'C GCGCCGAATTCAT3'，342 bp;GAPDH 上游引物:5'GGATTCGCCATTACT3'，下游引物:5'AGGATTAGCTT3'，520 bp。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳(含0.15 g/L溴乙啶)分離后，用DEL2000凝膠成像分析系統(tǒng)拍照分析。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡率 將正常腦組織神經(jīng)細(xì)胞和U251細(xì)胞在6孔板內(nèi)培養(yǎng)，接種密度4×105ml－1，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合后，PBS液清洗經(jīng)消化收集的細(xì)胞2～3次，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106ml－1，將細(xì)胞懸液100 μl轉(zhuǎn)移至試管中;加入FITC標(biāo)記的annexinⅤ和PI溶液，輕輕混勻;室溫避光放置10～15 min;加入400 μl緩沖液，將全部液體轉(zhuǎn)移至FCM分析用試管，用FCM進(jìn)行細(xì)胞周期分析，采用Becton Dickinson公司的Cell Fit進(jìn)行自動(dòng)分析，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)相所占比例及凋亡情況。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板;103～104細(xì)胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量200 μl(96孔培養(yǎng)板每孔容積370 μl)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，加入2 mg/ml MTT液(50 μl/孔);繼續(xù)培養(yǎng)3 h。吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液(150 μl/孔)，將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10 min，使結(jié)晶物溶解。酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值(檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞Gadd45a mRNA表達(dá) 正常人腦組織神經(jīng)細(xì)胞中的Gadd45a mRNA表達(dá)水平明顯高于U251細(xì)胞Gadd45a mRNA表達(dá)水平(P＜0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2 各組細(xì)胞的細(xì)胞周期比例 U251細(xì)胞在S期比例明顯高于正常人腦神經(jīng)細(xì)胞，G2～M期細(xì)胞比率明顯降低正常人腦神經(jīng)細(xì)胞(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

圖1 各組細(xì)胞Gadd45a mRNA表達(dá)

表1 各組細(xì)胞的細(xì)胞周期比例(n=5，%，±s)

表1 各組細(xì)胞的細(xì)胞周期比例(n=5，%，±s)

與正常腦神經(jīng)細(xì)胞比較:1)P＜0.05

組別 G0～G1期 S期 G2～M期正常腦神經(jīng)細(xì)胞42.21±2.67 45.94±2.91 11.85±1.55 U251細(xì)胞 27.32±2.23 70.95±2.441) 1.73±0.971)

2.3 各組細(xì)胞凋亡率 U251細(xì)胞凋亡率(17.81%±1.65%)明顯低于正常人腦神經(jīng)細(xì)胞(43.74% ±2.32%，P＜0.05)。

2.4 各組細(xì)胞增殖情況 U251細(xì)胞增殖率(77.12%±2.37%)明顯高于正常人腦神經(jīng)細(xì)胞(21.74% ±1.21%，P＜0.05)。

3 討論

腫瘤是機(jī)體在各種因素作用下，局部組織的細(xì)胞在基因水平上失去了對(duì)其生長(zhǎng)的正常調(diào)控，導(dǎo)致細(xì)胞的異常增生而形成的新生物。腫瘤是基因疾病，其生物學(xué)基礎(chǔ)是基因的異常。致瘤因素使體細(xì)胞基因突變，導(dǎo)致正常基因失常，基因表達(dá)紊亂，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)活性與遺傳特性，形成了與正常細(xì)胞在形態(tài)、代謝與功能上均有所不同的腫瘤細(xì)胞。腫瘤的發(fā)生是多基因、多步驟突變的結(jié)果。不同的基因的突變與不同強(qiáng)度的突變形成了不同的腫瘤。Gadd45基因是生長(zhǎng)抑制及DNA損傷誘導(dǎo)基因家族中的一員，是電離輻射效應(yīng)基因之一，在細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)及細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用，這使它成為維持基因組穩(wěn)定性的重要基因，在腫瘤細(xì)胞存活、凋亡信號(hào)通路中發(fā)揮錯(cuò)綜復(fù)雜的作用，從而參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。研究顯示Gadd45a介導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制與Gadd45a對(duì)細(xì)胞周期G2～M期監(jiān)測(cè)點(diǎn)和細(xì)胞凋亡的調(diào)控密切相關(guān)〔6〕。研究表明，Gadd45a進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)后與細(xì)胞周期分裂相關(guān)基因2(Cdc2)結(jié)合，形成Gadd45a/Cdc2復(fù)合體，由于此復(fù)合體不具有細(xì)胞周期依賴性激酶的作用，因此細(xì)胞無(wú)法由G2期進(jìn)入M期，從而導(dǎo)致細(xì)胞停滯在G2～M期〔7〕。同時(shí)有研究結(jié)果顯示，在Gadd45a基因敲除的上皮細(xì)胞，在紫外線輻射后，細(xì)胞凋亡受到抑制，提示，Gadd45a可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔8〕。本文結(jié)果顯示，Gadd45a基因在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)明顯下調(diào)，同時(shí)伴隨腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期停滯在G2～M期，細(xì)胞凋亡率明顯下降，增殖能力增強(qiáng)，與上述結(jié)果一致，證實(shí)Gadd45a基因作為機(jī)體的保護(hù)性基因，其表達(dá)缺失或下降，直接參與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展。因此，針對(duì)Gadd45a基因的靶向性研究可以成為腦膠質(zhì)瘤治療學(xué)方面的重點(diǎn)。

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