促紅細(xì)胞生成素對慢性腦缺血大鼠認(rèn)知障礙及海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響

陳 濤 周少華 劉南暖 葉 飛 章軍建 (武漢大學(xué)中南醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 武漢 43007)

慢性腦缺血常伴發(fā)于動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病和血管性癡呆等多種病理過程〔1〕。慢性腦缺血的病理過程持續(xù)的時間較長，損傷和修復(fù)的機(jī)制比較復(fù)雜，積極研究其病理生理機(jī)制可以為臨床上早期藥物干預(yù)提供更多的機(jī)會。促紅細(xì)胞生成素(EPO)及其受體廣泛地存在于在神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中，在缺血、缺氧和神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病中發(fā)揮著保護(hù)作用〔2〕。本實(shí)驗(yàn)觀察EPO對慢性腦缺血時大鼠認(rèn)知功能障礙與海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響，為慢性腦缺血的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物分組、模型制備和給藥 36只雄性Wistar大鼠(體重300～350 g)，購自四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所。隨機(jī)分為缺血組，EPO組，假手術(shù)組，每組12只。缺血組和EPO治療組將大鼠用10%水合氯醛(3.5 ml/kg)麻醉消毒后分離雙側(cè)頸總動脈，雙重絲線結(jié)扎后切斷。假手術(shù)組僅游離雙側(cè)頸總動脈。EPO治療組大鼠腹腔內(nèi)注射EPO 1 000 U/kg(重組人紅細(xì)胞生成素產(chǎn)自南京華欣藥業(yè)生物工程有限公司)，連續(xù)5 d。假手術(shù)組及缺血組動物等劑量PBS腹腔注射。

1.2 Morris水迷宮認(rèn)知功能測試 Morris水迷宮購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。正式實(shí)驗(yàn)前1 d三組大鼠在無逃逸平臺的水池中適應(yīng)性游泳2 min。次日將三組大鼠隨機(jī)從四個不同象限入水。以60 s為時限計(jì)大鼠從入水至爬上平臺的游泳距離，即隱匿平臺逃避路程。實(shí)驗(yàn)第5天完成逃避路程測試后后撤去平臺，將大鼠從平臺所在的對面象限中放入水池，記錄1 min內(nèi)大鼠在隱匿平臺所在象限的停留時間。

1.3 免疫組化檢測 Morris水迷宮測試結(jié)束后三組大鼠以10%水合氯醛(3.5 ml/kg)麻醉后暴露心臟，通過左心室插管到升主動脈，生理鹽水100 ml快速沖洗;以4%多聚甲醛0.1 mol/L PBS(pH7.4)400 ml灌注。石蠟包埋后制備含有海馬部位的冠狀腦部石蠟切片。每20張取3片?？酒竺撓炄腚p蒸水，再入PBS沖洗后用濾紙吸干水分后，加入3%H2O2-甲醇30 min，封閉內(nèi)源性過氧化物酶。按照說明書滴加兔抗GFAP血清(Sigma公司產(chǎn)品)，再滴入生物素化的羊抗兔IgG和SABC液(武漢博士德公司產(chǎn)品)，DAB-0.01%H2O2顯色5 min。以上各步驟間均用PBS充分漂洗。GFAP的陽性對照采用腦膠質(zhì)瘤切片進(jìn)行;陰性對照采用PBS代替一抗;其余步驟同上。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，結(jié)果采用單因素方差分析。相關(guān)性分析采用Pearson法。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮隱匿平臺逃避路程 從圖1結(jié)果(Fig1A)可以看到三組大鼠隨著訓(xùn)練天數(shù)增加，尋找隱匿平臺所需的逃避路程逐漸減少，但三組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力不同。缺血組和假手術(shù)組從水迷宮訓(xùn)練的第1天起相比，缺血組比假手術(shù)組的隱匿平臺逃避路程明顯延長(F=45.52，P＜0.05)，在第4～5天差異更明顯(F=156.85，P＜0.01)。而EPO組第2天的隱匿平臺逃避距離明顯短于缺血組(F=58.31，P＜0.05)，從第4天后兩者的成績差異比較穩(wěn)定，而且更具有顯著性(F=76.95，P＜0.01)。

2.2 隱匿平臺象限停留時間 假手術(shù)組和缺血組大鼠相比，缺血組大鼠停留隱匿平臺象限時間(9.000±1.78)s明顯短于假手術(shù)組大鼠(19.255±3.13)s(t=3.98，P＜0.01)。EPO組的隱匿平臺象限停留時間(15.000±2.29)s同缺血組相比也明顯縮短(t=2.06，P＜0.01)。

圖1 三組大鼠在Morris迷宮內(nèi)隱匿平臺逃避路程

2.3 海馬CA1區(qū)GFAP免疫組化結(jié)果以及與大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力相關(guān)性分析 三組大鼠海馬CA1區(qū)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)比較見圖2所示。缺血組大鼠海馬CA1區(qū)GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞呈蜘蛛狀，胞體肥大、突起增多、增粗、變長以及細(xì)胞數(shù)目明顯增多(圖2A);假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)也可見到少數(shù)GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞胞體較小、細(xì)胞數(shù)目很少、突起細(xì)短(圖2B);而EPO治療組海馬CA1區(qū)GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)明顯較缺血組弱(圖2C)(P＜0.01)，同假手術(shù)組相比EPO治療組海馬CA1區(qū)GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目差異無顯著性(t=1.65，P＞0.05)。慢性腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)與大鼠隱匿平臺象限停留時間做相關(guān)性分析后結(jié)果顯示:大鼠海馬CA1區(qū)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)與大鼠停留時間呈負(fù)相關(guān)性(r=－0.845，F(xiàn)=9.651，P＜0.01)。提示大鼠海馬CA1區(qū)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)與其空間學(xué)習(xí)記憶能力呈負(fù)相關(guān)。

圖2 三組大鼠海馬CA1區(qū)GFAP表達(dá)(SABC，×400)

3 討論

EPO是一種造血細(xì)胞因子，目前在臨床上廣泛用于腎性貧血等治療中。研究表明EPO可以降低谷氨酸興奮性毒性，誘導(dǎo)神經(jīng)抗凋亡因子的產(chǎn)生，減少炎癥反應(yīng)，減少細(xì)胞介導(dǎo)產(chǎn)生的TNF，增加IL-1的產(chǎn)生，減少應(yīng)激反應(yīng)對神經(jīng)元的損害，通過抑制NO的過度合成保護(hù)神經(jīng)元，增加神經(jīng)元的抗氧化酶活性，具有抗氧化效應(yīng)，能顯著改善認(rèn)知功能，具有明顯地神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用〔3～6〕。

永久性結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動脈可出現(xiàn)慢性腦低灌注狀態(tài)，目前被公認(rèn)為是慢性腦低灌注的較理想動物模型〔7〕。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)?zāi)芘懦齽游镌谕瓿勺鳂I(yè)而經(jīng)過的途中所留下的排泄物和所分泌的外激素對其他動物檢測結(jié)果產(chǎn)生的影響，主要用于評價(jià)海馬的認(rèn)知功能。我們觀察到用Morris水迷宮測試大鼠的空間記憶能力，慢性腦缺血大鼠的空間記憶能力明顯下降，表現(xiàn)為隱匿平臺逃避距離顯著延長，定位能力欠佳，隱匿平臺象限停留時間明顯減少，表明該模型可靠。而給予EPO治療后慢性腦缺血大鼠明顯縮短了逃避距離，增加了停留平臺象限時間，表明EPO可顯著改善認(rèn)知功能，神經(jīng)保護(hù)效果明顯。

膠質(zhì)細(xì)胞約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞總數(shù)的90%，星形膠質(zhì)細(xì)胞是其中主要的組成成分，擔(dān)負(fù)了膠質(zhì)細(xì)胞的大部分功能:神經(jīng)發(fā)生、發(fā)育與再生，合成和分泌細(xì)胞因子，血腦屏障，突觸形成和可塑性，免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)，神經(jīng)元信號傳遞等〔8，9〕。在致病因素刺激下，膠質(zhì)細(xì)胞可被激活，分泌產(chǎn)生許多細(xì)胞因子參與免疫、吞噬及炎癥。研究顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞與認(rèn)知功能損害密切相關(guān)〔10～12〕。海馬是參與空間學(xué)習(xí)記憶的重要結(jié)構(gòu)，并且它對缺血缺氧十分敏感，尤其是CA1區(qū)，慢性腦缺血時的腦部低灌注可以引起海馬部神經(jīng)元損傷，通常認(rèn)為海馬神經(jīng)元受損可能是慢性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力障礙的病理基礎(chǔ)。龍大宏等〔13〕觀察結(jié)果顯示，穹窿海馬傘損害大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力與海馬CA1區(qū)和齒狀回內(nèi)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)密度呈負(fù)相關(guān)，認(rèn)為海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞參與了學(xué)習(xí)記憶過程。本實(shí)驗(yàn)提示EPO可能通過抑制星型膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增生發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，從而改善慢性腦缺血大鼠的認(rèn)知功能。但有關(guān)具體機(jī)制仍需要下一步深入研究。

1 De La Torre，Jack C.Alzheimer，s disease is a vasocognopathy:a new term to describe its nature〔J〕.Neurol Res，2004;26(5):517-24.

2 Juul S.Erythropoietin in the central nervous system and its use to prevent hypoxic-ischemic brain damage〔J〕.Acta Paediatr Suppl，2002;91:36.

3 Chen ZY，Asavaritikrai P，Prchal JT，et al.Endogenous erythropoietin signaling is required for normal neural progenitor cell proliferation〔J〕.J Biol Chem，2007;282(35):25875-83.

4 Kim SS，Lee KH，Sung DK，et al.Erythropoietin attenuates brain injury，subventricular zone expansion，and sensorimotor deficits in hypoxic-ischemic neonatal rats〔J〕.J Korean Med Sci，2008;23(3):484-91.

5 Wei L，Han BH，Li Y，et al.Cell death mechanism and protective effect of erythropoietin after focal ischemia in the whisker-barrel cortex of neonatal rats〔J〕.J Pharmacol Exp Ther，2006;317(1):109-16.

6 Sun Y，Zhou C，Polk P，et al.Mechanisms of erythropoietin-induced brain protection in neonatal hypoxia-ischemia rat model〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，2004;24(2):259-70.

7 Sarti C，Pantoni L，Bartolini L，et al.Cognitive impairment and chronic cerebral hypoperfusion:what can be learned from experimental models〔J〕.J Neurol Sci，2002;203-4:263-6.

8 Tarkowski E，Liljeroch AM，Minthon L，et al.Cerebral pattern of pro-and antiinflammatory cytokines in dementias〔J〕.Brain Res Bull，2003;61(3):255.

9 Pavelko KD，Howe CL，Drescher KM，et al.Interleukin-6 protects anterior hom neurons from lethal virus-induced injury〔J〕.J Neurosci，2003;23(2):481.

10 劉冬戈，何淑蓉，張 偉，等.阿爾芡海默病神經(jīng)細(xì)胞凋亡與小膠質(zhì)細(xì)胞活化的關(guān)系〔J〕.中華病理學(xué)雜志，2004;33(5):404-7.

11 Barker AJ，Ullian EM.Astrocytes and synaptic plasticity〔J〕.Neuroscientist，2010;16(1):40-50.

12 Huang Z，Liu J，Cheung PY，et al.Long-term cognitive impairment and myelination deficiency in a rat model of perinatal hypoxic-ischemic brain injury〔J〕.Brain Res，2009;1301(1):100-9.

13 龍大宏，楊丹迪，李佳楣，等.穹窿海馬傘損傷對大鼠學(xué)習(xí)記憶和海馬GFAP陽性神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的影響〔J〕.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2002;18(1):63-6.