氧化應(yīng)激與DNA損傷

冉茂良 高 環(huán) 尹 杰 陳 斌*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128;2.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心，農(nóng)業(yè)部中南動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，長沙 410125;3.中國科學(xué)院研究生院，北京 100049)

人和動(dòng)物機(jī)體內(nèi)由于細(xì)胞呼吸和能量代謝時(shí)刻發(fā)生著有氧氧化，在細(xì)胞中產(chǎn)生活性氧分子(reactive oxygen species，ROS)，如超氧陰離子(·O-2)和羥自由基(·OH)等自由基。當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)外環(huán)境的刺激后，ROS產(chǎn)生增多，從而破壞了機(jī)體氧化與抗氧化系統(tǒng)之間的平衡，最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激(圖1)［1-3］。過多的ROS能夠激活核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)、核轉(zhuǎn)錄因子 -κB(NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)等，從而調(diào)節(jié)許多氧化物質(zhì)和抗氧化物質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)［4-5］。不僅如此，蛋白質(zhì)和DNA也是ROS的攻擊靶標(biāo)，ROS能夠造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)突變或喪失生物活性、DNA鏈斷裂、DNA位點(diǎn)突變、DNA雙鏈畸變和原癌基因與腫瘤抑制基因突變，最終導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生氧化損傷［6-7］。DNA作為生物體最重要的遺傳物質(zhì)能夠保持其自身一定的穩(wěn)定性，但是DNA卻經(jīng)常發(fā)生內(nèi)在的自發(fā)性損傷和遭受X射線、紫外線、烷化劑、嵌入劑等外在刺激而發(fā)生損傷，據(jù)統(tǒng)計(jì)每個(gè)細(xì)胞內(nèi)的DNA在24 h內(nèi)出現(xiàn)10 000次損傷。而DNA損傷能夠加速細(xì)胞的衰老和凋亡、引起癌癥和腫瘤等疾病。不僅如此，有研究報(bào)道DNA損傷也可以誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生［8］，且對(duì)細(xì)胞死亡和自救有重要的作用［9］，其原因可能是由于ROS能調(diào)節(jié)p53基因(一種抗癌基因)的活性［10-11］。由此可見，ROS可引起DNA損傷，而DNA損傷也可以誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS，因而氧化應(yīng)激和DNA之間存在著一定的聯(lián)系。

1 ROS和氧化應(yīng)激信號(hào)通道

1.1 ROS的產(chǎn)生

大量研究表明，ROS有2種來源:一種是內(nèi)源性，線粒體呼吸鏈氧化磷酸化過程活性氧泄漏、過氧化酶體和被激活的炎性細(xì)胞等［12］;另一種是外源性，例如外源物、病原體、促炎細(xì)胞因子和重金屬等［13］。盡管細(xì)胞色素 p450氧化酶也能產(chǎn)生ROS，但線粒體仍是細(xì)胞ROS最重要的來源。研究表明，在線粒體呼吸鏈輔酶還原型輔酶Ⅰ(NADH)、泛醌氧化還原酶和泛醌細(xì)胞色素C氧化還原酶的作用下，0.15%的氧被轉(zhuǎn)化為ROS，其中主要是·，由于·能攻擊細(xì)胞內(nèi)許多大分子(如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA)且能通過酶催化反應(yīng)產(chǎn)生其他 ROS，如·OH和過氧化氫(H2O2)等，因而·被視為“首要 ROS”［15］。·O2-在超氧化物歧化酶(SOD)的催化作用下被轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2，H2O2通過過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和Fenton反應(yīng)被清除。其中過氧化氫酶能夠通過歧化反應(yīng)將2分子H2O2轉(zhuǎn)化為1分子O2和2分子H2O，GPx利用一些還原劑將H2O2轉(zhuǎn)化為2分子H2O，F(xiàn)enton反應(yīng)則是在Fe2+的催化下將H2O2分解生成·OH［1，16］。盡管·OH的半衰期(大約10-9s)非常短，但其活性很高，幾乎對(duì)所有大分子(如碳水化合物、核酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì))造成損傷［17］(圖 2)。

圖1 促氧化和抗氧化系統(tǒng)間的平衡模型Fig.1 Balance model between pro-oxidative and anti-oxidative systems［1］

圖2 SOD將·轉(zhuǎn)化為H2O2后的已知途徑Fig.2 Clear pathways after· transformed into H2O2by SOD

1.2 解耦聯(lián)蛋白(uncoupling proteins，UCPs)系統(tǒng)的反饋調(diào)節(jié)

UCPs是線粒體內(nèi)膜上的一種具有調(diào)節(jié)質(zhì)子跨膜作用的特殊蛋白質(zhì)。目前在哺乳動(dòng)物體內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn) 5 種 UCPs，分別為:UCP1、UCP2、UCP3、UCP4 和 UCP5［18-19］。研 究 表 明，在 UCPs 家 族中，僅UCP2和UCP3能夠?qū)ρ趸瘧?yīng)激起反饋調(diào)節(jié)的作用。例如，UCP2基因敲除的小鼠較正常小鼠大腦線粒體在氧化應(yīng)激下能夠產(chǎn)生更多的ROS［20］，此外，UCP3 基因的過度表達(dá)也能顯著降低細(xì)胞衰老誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生［21］。UCPs反饋調(diào)節(jié)ROS的機(jī)制是:UCPs通過降低質(zhì)子電化學(xué)梯度，使呼吸作用中電子傳遞過程和ATP的合成解耦聯(lián)，因此將儲(chǔ)存的能量以熱能的形式釋放，并提高靜息代謝率，其中UCPs通過調(diào)節(jié)質(zhì)子泄漏(proton leak)以降低 ROS 的產(chǎn)量(圖3)［22］。研究表明:呼吸鏈賦予質(zhì)子的高運(yùn)動(dòng)能力，使給氧分子提供1個(gè)電子而變成·的電子載體在穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)的濃度升高，由此增加了·的量;·下游衍生物羥基壬烯酸激活電子漏，使膜電位降低，隨后通過呼吸鏈刺激電子流量，使得給氧提供1個(gè)電子而變成·的電子載體的在穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)的濃度降低，因此UCPs對(duì)ROS的生成有一個(gè)負(fù)反饋機(jī)制，其功能是通過脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物來抵抗氧化應(yīng)激，但是羥基壬烯酸在UCPs反饋調(diào)節(jié)ROS 的機(jī)制尚不清楚［23-24］。

1.3 氧化應(yīng)激信號(hào)通道

氧化應(yīng)激能夠破壞細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，從而激活或抑制許多信號(hào)通路和一些信號(hào)介導(dǎo)分子，如核因子 E2相關(guān)因子2-胞質(zhì)伴侶蛋白(Nrf2/Keap1)信號(hào)通道［4］、NF-κB 信號(hào)通道［5］，MAPKs［25］，激酶蛋白 mTOR(一個(gè)蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵調(diào)控子)［26］和蛋白激酶 C(PKC)［27］等，最終調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。其中Nrf2/Keap1是細(xì)胞內(nèi)抵抗氧化應(yīng)激和保持氧化還原平衡的重要信號(hào)通道之一［28］，Nrf2是一種氧化應(yīng)激基本表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，存在于全身多個(gè)器官，它的缺失或激活障礙直接引起細(xì)胞對(duì)應(yīng)激源的敏感性變化。因此，本文主要綜述了ROS對(duì)Nrf2/Keap1信號(hào)通路的影響。

Keap1是Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中的富含半胱氨酸的結(jié)合蛋白，主要通過結(jié)合Nrf2使之無法進(jìn)入細(xì)胞核，從而抑制Nrf2的活性，避免引起細(xì)胞對(duì)應(yīng)激源的敏感性升高，例如敲除Keap1的基因?qū)е翹rf2信號(hào)非?；钴S［29-30］。在無應(yīng)激條件下，Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中通過與Keap1結(jié)合而被抑制，而當(dāng)在氧化應(yīng)激或過量ROS刺激時(shí)，半胱氨酸在Keap1中的殘留量會(huì)增加，隨后Keap1作為E3連接酶的活性變?nèi)酰?1］，Nrf2和 Keap1之間的連接被打亂，導(dǎo)致Nrf2泛化和衰退減少，細(xì)胞質(zhì)中自由的Nrf2增多，轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞核的Nrf2增多［32-33］，進(jìn)入細(xì)胞核的Nrf2與小Maf蛋白形成異源二聚體，并且和抗氧化反應(yīng)元件(ARE)連接在一起。隨后，ARE被激活并啟動(dòng)抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄［34］，從而使得抗氧化基因得以表達(dá)。但是Li等［32］研究報(bào)道:細(xì)胞內(nèi)存在2種Nrf2蛋白，一種是游離Nrf2(f Nrf2)，另一種是與Keap1結(jié)合的Nrf2(kNrf2)，在無應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞質(zhì)內(nèi)絕大多數(shù)Nrf2是處于與Keap1結(jié)合的狀態(tài)，只有少量fNrf2進(jìn)入細(xì)胞核以保持氧化還原平衡;在ROS過量時(shí)，由于Keap1的自我泛素化使得Keap1與Nrf2的結(jié)合量達(dá)到飽和或減少［35-36］，從而f Nrf2的量增多，進(jìn)入細(xì)胞核強(qiáng)化抗氧化基因的表達(dá)［32］。這2種 Nrf2/Keap1信號(hào)通道機(jī)制的關(guān)鍵不同之處是:前一種認(rèn)為氧化還原信號(hào)是從Keap1到Nrf2的，而后一種認(rèn)為Keap1和Nrf2都對(duì)氧化還原信號(hào)有高度的敏感性［32］。但是如前面敘述的細(xì)胞內(nèi)在無應(yīng)激狀態(tài)下也時(shí)刻都產(chǎn)生ROS，因而細(xì)胞要保持氧化還原狀態(tài)，也必須時(shí)刻都有fNrf2進(jìn)入細(xì)胞核促使抗氧化基因表達(dá)，所以認(rèn)為 Li等［32］對(duì) Nrf2/Keap1信號(hào)通道機(jī)制的研究更為合理。

2 DNA損傷及其反應(yīng)機(jī)制

動(dòng)物體內(nèi)DNA經(jīng)常受到來自體內(nèi)外各種因素的刺激，例如:外源性的高溫高壓、紫外線、射線、重金屬、強(qiáng)氧化劑、強(qiáng)酸和強(qiáng)堿等物理化學(xué)因素和內(nèi)源性ROS、酸堿不平衡及DNA在復(fù)制和傳遞過程中出現(xiàn)的錯(cuò)誤等，這些因素都將導(dǎo)致DNA損傷。DNA損傷的形式有多種，如DNA雙鏈結(jié)構(gòu)破壞(DSBs)［37］、DNA 鏈斷裂、堿基或堿基對(duì)被切除或替換等。此外，DNA損傷會(huì)引發(fā)多種細(xì)胞反應(yīng)，包括DNA修復(fù)、細(xì)胞周期延遲或阻滯、細(xì)胞凋亡［38］等。由于DNA損傷的形式有多種，因而其損傷反應(yīng)的機(jī)理也各不相同，由于DSBs出現(xiàn)在多種原因?qū)е碌腄NA損傷中［39］，本文主要介紹了DSBs誘發(fā)的反應(yīng)。

DSBs是DNA損傷中最具有致命性作用的損傷之一，若DSBs沒有被成功修復(fù)，不僅危及細(xì)胞的自我更新和分化能力，而且導(dǎo)致染色體組不穩(wěn)定和疾?。?9］。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)MRN復(fù)合體(由 Mre11、Rad50和 Nbs1組成)感應(yīng)到 DSBs時(shí)，立即激活運(yùn)動(dòng)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變蛋白(ataxia telangiectasia mutated，ATM)，磷脂酰肌醇-3-激酶 β(phosphoinositide 3-kinaseβ，PI3Kβ)也是感應(yīng)染色體結(jié)構(gòu)完整性的一個(gè)重要感受器［40］，PI3K相關(guān)激酶(PIKK)家族的成員參與組織DNA損傷反應(yīng)［41-42］。其中ATM 能使細(xì)胞周期控制、DNA修復(fù)和染色體結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)中的700多種蛋白質(zhì)磷酸化，包括p53、細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激酶 2(Chk2)和組蛋白家族成員 X(H2AX)［43］，并且有研究表明，ATM在氧化應(yīng)激反應(yīng)中也起到關(guān)鍵的作用［44］。被激活的ATM導(dǎo)致H2AX快速磷酸化形成γ-H2AX，從而在損傷處標(biāo)定DNA損傷信號(hào)和積累修復(fù)蛋白，γ-H2AX能被小腦癥蛋白(MCPH1)和DNA損傷調(diào)節(jié)蛋白1(MDC1)識(shí)別，MDC1通過磷酸酶和組蛋白交換因子的活動(dòng)擴(kuò)大依賴ATM的信號(hào)，與此同時(shí)也促進(jìn)了其他DSBs信號(hào)和修復(fù)蛋白的積累，最終DNA損傷信號(hào)導(dǎo)致檢查點(diǎn)蛋白激酶細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激酶1(Chk1)和Chk2被激活，Chk1和Chk2能修改細(xì)胞周期的部分機(jī)制使得細(xì)胞周期停止［45］。細(xì)胞在長期進(jìn)化過程中產(chǎn)生細(xì)胞周期檢測點(diǎn)(探測器包括Rad9和Rad17等)以保證細(xì)胞周期中DNA復(fù)制和染色體質(zhì)量的機(jī)制，由于DNA損傷可以發(fā)生在細(xì)胞周期的任何時(shí)相，因而DNA損傷檢查點(diǎn)又可分為:G1期、M 期和 S2期檢查點(diǎn)［46］。若 G1期發(fā)生 DNA損傷，激活后的Chk1和Chk2可以磷酸化細(xì)胞分裂周期蛋白25A(Cdc25A)，使其降解，即沒有足夠的Cdc25A清除細(xì)胞周期素依賴性激酶2(CDK2)上抑制其活性位點(diǎn)的磷酸基團(tuán)，使得Cdc25A不能被激活，從而不能推動(dòng)G1期向S期轉(zhuǎn)換，引起細(xì)胞周期停滯［40］;若S期發(fā)生DNA損傷，Chk1和Chk2抑制了CDK2活性，Cdc45不能組裝到染色質(zhì)上，Cdc45可以召集DNA聚合酶α，從而大大降低了DNA合成速度以延緩細(xì)胞周期［40，47］;若 G2 期發(fā)生 DNA 損傷，Cdc25A 被泛素降解而不能激活細(xì)胞周期素依賴性激酶1(CDK1)，且G2期檢查點(diǎn)還會(huì)激活一條依賴p53的途徑以停滯細(xì)胞周期［40，48］。細(xì)胞周期停滯或延緩后，通過堿基切除修復(fù)、核酸切除修復(fù)、重組修復(fù)和錯(cuò)配修復(fù)等方式修復(fù)受損DNA，如損傷不能修復(fù)或不能正確完成，則啟動(dòng)凋亡或非凋亡性死亡程序，清除有損傷或病變傾向的細(xì)胞［49］。值得注意的是，有研究報(bào)道，表皮生長因子受體(EGFR)與細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和蛋白激酶B(PKB)串聯(lián)的信號(hào)對(duì)依賴ATM修復(fù)DNA損傷的反應(yīng)有積極影響［50-51］，并且修復(fù)DSBs有2條主要的途徑，分別是同源重組(HR)和末端加入的非同源(non-homologous end-joining，NHEJ)，這 2 條途徑見的平衡是保持基因組穩(wěn)定所必需的［52］。

3 ROS與DNA損傷之間的聯(lián)系

大量研究表明，ROS能夠引起氧化損傷，并攻擊蛋白質(zhì)和DNA，會(huì)引起包括DNA鏈斷裂、DNA位點(diǎn)突變、DNA雙鏈畸變和原癌基因與腫瘤抑制基因突變等形式的DNA損傷［6］，例如，嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞引起的ROS能直接導(dǎo)致DNA脫氨基和堿基氧化［53］。不僅如此，DNA損傷可以提升細(xì)胞內(nèi)ROS水平［8］，且 DNA損傷誘導(dǎo)的 ROS在調(diào)節(jié)細(xì)胞的死亡和自救中起到很重要的作用［9］。由此說明DNA損傷和ROS引起的氧化應(yīng)激之間存在著一定的聯(lián)系。

3.1 ROS引起的氧化應(yīng)激導(dǎo)致DNA損傷

過多的ROS引起的氧化損傷會(huì)導(dǎo)致包括DNA鏈斷裂、DNA位點(diǎn)突變、DNA雙鏈畸變等形式的DNA損傷，但是與核DNA(nDNA)相比，線粒體DNA(mtDNA)更容易遭受氧化傷害［54］。有報(bào)道稱，ROS對(duì) mtDNA突變影響更大［55］。大多數(shù)mtDNA突變的形式是:胸腺嘧啶(T)轉(zhuǎn)變?yōu)榘奏?C)，鳥嘌呤(G)轉(zhuǎn)變?yōu)橄汆堰?A)［56］。而ROS可使G氧化為8-氧鳥嘌呤(8-oxoG)，而8-oxoG不再與C配對(duì)，反而與A配對(duì)，使得G轉(zhuǎn)變?yōu)锳［57］。此外，F(xiàn)enton反應(yīng)分解H2O2生成的高活性·OH能高效地?fù)p傷DNA，包括:DNA鏈斷裂、DNA位點(diǎn)突變、DNA雙鏈畸變。并且線粒體呼吸鏈產(chǎn)生的ROS導(dǎo)致的mtDNA損傷和突變能反過來使呼吸鏈功能失效，從而進(jìn)一步促進(jìn)ROS的產(chǎn)生［58］。由此說明，ROS引起的氧化應(yīng)激與 DNA損傷之間有相互促進(jìn)作用。

3.2 DNA損傷引起的ROS導(dǎo)致氧化應(yīng)激

在細(xì)胞培養(yǎng)中，DNA損傷已被證明可以刺激細(xì)胞中 ROS 產(chǎn)生［59］，如·、H2O2和·OH［60］。DNA損傷后的2 h內(nèi)ROS量迅速增加，2.0～3.5 h逐漸減少，3.5～5.0 h內(nèi)出現(xiàn)第2次迅速增加［61］，但其機(jī)制仍不清楚。有研究表明，DNA損傷通過H2AX-還原型輔酶Ⅱ氧化酶1(Nox1)/Rac1通道誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，H2AX的超量表達(dá)和基因敲除都證明H2AX能調(diào)節(jié)ROS的產(chǎn)生［61］，其原因可能是由于DNA損傷后導(dǎo)致H2AX被磷酸化的量增加，H2AX通過掩蔽14-3-3zeta［14-3-3zeta蛋白是14-3-3家族的一個(gè)成員，通常以二聚體的形式存在，在真核細(xì)胞中普遍存在，它能同時(shí)接受2個(gè)配體(如受體蛋白和激酶等)，是信號(hào)傳導(dǎo)通路中的重要接頭蛋白［60］］，激活 Rac1、GTP 酶和Nox1，從而引起細(xì)胞內(nèi) ROS的量增加。其中，Nox1是gp91(phox)(一個(gè)NADPH氧化酶的亞單位)的同源分子，其基因可在非噬細(xì)胞(上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等)內(nèi)表達(dá)，能被Rac1(細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子)激活。研究表明，減少Rac1的生成能減少依賴Nox1產(chǎn)生的ROS量［62］。

4 小結(jié)

綜上所述，若ROS引起的氧化應(yīng)激和各種原因誘導(dǎo)的DNA損傷超過了動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞自我修復(fù)的能力，將會(huì)對(duì)動(dòng)物機(jī)體造成各種損傷，如腫瘤、癌癥、細(xì)胞衰老甚至凋亡等，并且DNA損傷和氧化應(yīng)激之間存在著必然的聯(lián)系。但是一些細(xì)胞自我修復(fù)和抵抗各種應(yīng)激與ROS和DNA損傷的機(jī)制尚不清楚，并且氧化應(yīng)激和DNA損傷對(duì)機(jī)體細(xì)胞造成損傷的廣泛性及其在動(dòng)物生產(chǎn)中產(chǎn)生的影響需要做進(jìn)一步的研究。

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