鴨空腸液中消化酶粗提純方法的比較研究

張 莉 趙 峰 嚴 峰 米寶民 張宏福

(中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193)

在體外模擬消化中，模擬消化液的制備一直是核心技術(shù)之一。據(jù) Crévieu-Gabriel等［1］報道，從生長豬與肉雞體內(nèi)獲得的胃蛋白酶在酶學特性上，如針對不同底物的最適pH、消化能力等方面有較大的差異。由此可見，在模擬消化液中，主要消化酶所來源的動物種屬與模擬對象的動物種屬相一致是提高模擬消化液仿真程度的關(guān)鍵因素之一。因此，尋求一種快速、有效獲取動物體內(nèi)消化酶的方法迫在眉睫。目前，在對動物體內(nèi)的消化酶提取時，多采用鹽析、透析及超濾等方法進行前處理，再根據(jù)目的酶蛋白的不同，采用不同型號規(guī)格的凝膠層析柱進行過濾，以相應(yīng)的緩沖液洗脫并收集峰濃度時的消化酶進行提純，如淀粉酶［2-3］、胰蛋白酶［4-7］、糜蛋白酶［6-7］、脂肪酶［8］等多采用該方法。通過這些方法提純酶蛋白時，隨著步驟的增加酶蛋白的損失提高，活性回收率降低。而且，這些方法獲得的酶蛋白的回收率變異較大，不利于消化酶制備的質(zhì)量控制。因此，探討一套步驟簡單、消化酶回收率高且可重復(fù)的腸液消化酶粗提方法對解決體外模擬消化中消化酶的來源非常關(guān)鍵。為此，本研究以鴨為試驗動物，在前期已建立了鴨腸道瘺管的安裝方法［9-10］，并可實現(xiàn)從鴨體內(nèi)大量獲取空腸液這一主要原材料的基礎(chǔ)上，比較硫酸銨沉淀-透析-凍干法和低溫濃縮-透析-凍干法獲得的鴨空腸液凍干粉劑在主要消化酶活性與回收率、總蛋白濃度與回收率及化學成分含量上的差異。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)粗提純腸液消化酶粉劑中化學成分的組成，進一步探討乙醇脫脂后，硫酸銨沉淀-透析-凍干-脫脂法和低溫濃縮-透析-凍干-脫脂法獲得的鴨空腸液凍干粉劑在消化酶活性與回收率上的差異，為最終獲得鴨空腸液消化酶粉劑的制備方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗鴨及空腸液的制備

選用80只健康、體重基本一致［(3.25±0.5)kg］的18周齡成年北京公鴨，參考鴨的空腸食糜連續(xù)采集方法在卵黃囊憩室部位安裝瘺管，并進行相應(yīng)的術(shù)后護理［9-10］。術(shù)后第4、5、6天試驗鴨分別限量飼喂50、100、150 g玉米-豆粕型飼糧(表1)。術(shù)后第7天開始，試驗鴨自由采食。待術(shù)后恢復(fù)30 d后，在瘺管出口處的皮脂上縫合一中央有孔的瓶蓋(孔正好穿過瘺管)。3 d后，按照趙峰等［9］隔日重復(fù)采樣的方法于采樣日期的09:30—10:30、13:30—14:30、17:30—18:30 通過收集瓶在低溫(0～4℃)條件下收集鴨空腸食糜。每次收集后將食糜搖勻，然后全部轉(zhuǎn)移至250 mL離心瓶中，于4℃、1 250×g條件下離心10 min。取上清液裝于1 000 mL樣品瓶中，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｕ麄€鴨空腸食糜采集期為4 d，共獲得8 L制備好的空腸液。

1.2 試驗設(shè)計

本試驗采用兩樣本完全隨機設(shè)計，將制備的8 L鴨空腸液充分混合均勻，隨機分成2組，每組4個重復(fù)，每個重復(fù)1 L腸液。其中第1組采用硫酸銨沉淀-透析-凍干法制備鴨空腸液消化酶粉劑，第2組采用低溫濃縮-透析-凍干法制備鴨空腸液消化酶粉劑，比較2種粗提純方法制備的消化酶粉劑中主要消化酶(淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶)活性與回收率、總蛋白濃度與回收率及化學成分含量的差異。然后在2種粗提純方法的基礎(chǔ)上，對制備的鴨空腸液消化酶粉劑進行乙醇脫脂處理，進一步比較硫酸銨沉淀-透析-凍干-脫脂法與低溫濃縮-透析-凍干-脫脂法制備的消化酶粉劑中主要消化酶活性與回收率、總蛋白濃度與回收率及化學成分含量的差異。

表1 鴨飼糧組成及營養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrient levels of the diet for ducks %

1.3 鴨空腸液消化酶的粗提純方法

1.3.1 硫酸銨沉淀-透析-凍干法

依照0℃時的硫酸銨飽和度計算表，配制10 L飽和硫酸銨溶液，并將其pH調(diào)節(jié)至7.0;配制0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液3 L備用。取冷凍的北京鴨空腸液4 L左右流水下迅速解凍，200目紗布過濾混勻后，用移液器取6 mL原腸液分裝于1 mL離心管中，速凍，待測消化酶活性和總蛋白濃度;其余空腸液取4等份各1 000 mL，每份按70%硫酸銨濃度［11］于冰浴下緩慢并不斷攪拌加入pH 7.0的飽和硫酸銨溶液2 333 mL，充分攪拌混合，4℃冰箱靜置30 min后于4 000 r/min離心20 min，棄上清液，沉淀用少量0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，并將復(fù)溶物無損失地轉(zhuǎn)入已裝好透析袋的玻璃透析管中，連接好進出水管道，用蛋白質(zhì)透析純化系統(tǒng)透析200 min(其中40 min×2次0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液透析，40 min×3次去離子水透析)，透析結(jié)束后用LGJ-4凍干機冷凍干燥制成鴨空腸液消化酶粉劑。

Change and Reconstruction of Khokhnuur Mongolian Food Culture in the Historically

取冷凍的北京鴨空腸液4 L左右于流水下迅速解凍后，經(jīng)200目紗布過濾，混勻后留取6 mL腸液于1 mL離心管中，速凍，待測消化酶活性與總蛋白濃度。其余腸液取4等分各1 000 mL，倒入LGJ-4冷凍干燥機托盤中，冷凍濃縮體積減少2/3以上，用少量去離子水復(fù)溶后，全部倒入已裝好透析袋的透析管中，用蛋白質(zhì)透析純化系統(tǒng)透析200 min(40 min×5次去離子水透析)。透析后繼續(xù)用凍干機冷凍干燥制成鴨空腸液消化酶粉劑。

1.3.2 SOP培訓法 每月由護士長或培訓教師按SOP教材統(tǒng)一培訓1次，帶教老師及培訓學員均必須嚴格按SOP要求在臨床工作中教學及操作，并有護士長及培訓教師進行監(jiān)督。

1.3.2 低溫濃縮-透析-凍干法

1.3.3 硫酸銨沉淀-透析-凍干-脫脂法

由表2可見，從2種方法制備的鴨空腸液消化酶粉劑中消化酶活性的差異看，低溫濃縮-透析-凍干法制備的粉劑在胰蛋白酶、糜蛋白酶及淀粉酶的活性上分別比硫酸銨沉淀-透析-凍干法所制備粉劑高27.9%、12.1%和34.8%(P＜0.05)，低溫濃縮-透析-凍干法與硫酸銨沉淀-透析-凍干法制備的粉劑在3種消化酶活性的平均變異系數(shù)分別為4.3%與5.0%。在消化酶回收率上，低溫濃縮-透析-凍干法制備的粉劑在胰蛋白酶、糜蛋白酶及淀粉酶的回收率上分別比硫酸銨沉淀-透析-凍干法所制備粉劑高35.2%、15.3%和34.8%(P＜0.05)，低溫濃縮-透析-凍干法與硫酸銨沉淀-透析-凍干法制備的粉劑在3種消化酶回收率的平均變異系數(shù)分別為4.9%與8.3%。2種粗提純方法制備的粉劑在總蛋白濃度上無顯著性差異(P＞0.05)，但在總蛋白回收率上，低溫濃縮-透析-凍干法顯著高于硫酸銨沉淀-透析-凍干法(P＜0.05)。在2種方法制備粉劑的化學成分含量的差異上，低溫濃縮-透析-凍干法制備的粉劑在粗蛋白質(zhì)及粗灰分含量上顯著低于硫酸銨沉淀-透析-凍干法(P＜0.05)，而2方法制備的粉劑在粗脂肪含量上無顯著性差異(P＞0.05)。

將硫酸銨沉淀-透析-凍干法獲得的鴨空腸液消化酶粉劑，每個重復(fù)取5 g放入G4玻璃砂芯坩堝中，加入45 mL無水乙醇，自流沖洗，共沖洗3次。結(jié)束后用LGJ-4凍干機冷凍干燥制成鴨空腸液消化酶脫脂粉劑。

α-淀粉酶(EC.3.2.1.1)活性以可溶性淀粉為底物進行測定［12］，淀粉酶活性單位定義為25℃、pH 6.90條件下每分鐘釋放1μmol麥芽糖所具有的活性;胰蛋白酶活性以對-苯磺酸-L-精氨酸甲酯(TAME)為底物進行測定［13］，胰蛋白酶活性單位定義為25℃、pH 8.10條件下每分鐘釋放1μmol對-甲苯磺酸-L-精氨酸時所具有的活性;糜蛋白酶活性以苯甲酰-L-酪氨酸乙酯(BTEE)為底物進行測定［14］，糜蛋白酶活性單位定義為在25℃、pH 7.80條件下每分鐘釋放1μmol苯甲酰-L-酪氨酸所具有的活性。

結(jié)合表3不同植被恢復(fù)模式AWCD的方差分析表明，刺槐+山杏+紫花苜蓿(0.94±0.44)和油松+旱柳+紅豆草混交林(0.65±0.38)土壤微生物利用碳源的量顯著高于自然恢復(fù)（P<0.01），而青海云杉+油松+河北楊和刺槐+油松混交模式下土壤微生物利用碳源的量顯著低于自然恢復(fù)（P<0.01），即刺槐+山杏+紫花苜?；旖涣滞寥牢⑸锎x活性最強，而刺槐+油松(0.45±0.32)和青海云杉+油松+河北楊混交林(0.26±0.18)相對于自然恢復(fù)土壤微生物代謝活性相對較弱。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 主要消化酶活性的測定

1.3.4 低溫濃縮-透析-凍干-脫脂法

1.4.2 總蛋白濃度的測定

粗蛋白質(zhì)、粗灰分及粗脂肪含量分別參照GB/T 6432—1994、GB/T 6438—2007 和 GB/T 6433—2006測定。

采用總蛋白試劑盒(南京建成生物科技有限公司生產(chǎn))以考馬斯亮藍比色法測定。

1.4.3 化學成分含量的測定

將低溫濃縮-透析-凍干法獲得的鴨空腸液消化酶粉劑，每個重復(fù)取5 g放入G4玻璃砂芯坩堝中，加入45 mL無水乙醇，自流沖洗，共沖洗3次。結(jié)束后用LGJ-4凍干機冷凍干燥制成鴨空腸液消化酶脫脂粉劑。

20年后，隨著定向刨花板(OSB)的引入該協(xié)會再次擴大，20世紀90年代，其范圍擴大到其他工程木產(chǎn)品，如膠合木、工字梁和結(jié)構(gòu)復(fù)合木材(SCL)。1994年，更名為工程木協(xié)會(Engineered Wood Association，APA)。

1.5 數(shù)據(jù)計算與統(tǒng)計分析

消化酶回收率、總蛋白回收率采用如下公式計算:

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，采用SAS 9.1.3統(tǒng)計軟件對硫酸銨沉淀-透析-凍干法與低溫濃縮-透析-凍干法，硫酸銨沉淀-透析-凍干-脫脂法與低溫濃縮-透析-凍干-脫脂法制備的鴨空腸液消化酶粉劑在消化酶活性與回收率、總蛋白濃度與回收率和化學成分含量上分別作兩樣本的T檢驗，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸銨沉淀-透析-凍干法與低溫濃縮-透析-凍干法制備鴨空腸液消化酶粉劑的消化酶活性與回收率、總蛋白濃度與回收率及化學成分含量的差異

25分鐘，比一頓飯時間都長。浙江桐廬縣一大貨車停在高速硬路肩上，車身占1/3的行車道，且未設(shè)警示牌。交警上前查看，竟然看見駕駛員竟然在用電磁爐炒菜，一會兒還準備加湯涮火鍋。

表2 硫酸銨沉淀-透析-凍干法與低溫濃縮-透析-凍干法制備鴨空腸液消化酶粉劑的消化酶活性與回收率、總蛋白濃度與回收率及化學成分含量Table 2 Activity and recovery rate of digestive enzyme，concentration and recovery rate of total protein and chemical composition content of duck jejunal digestive enzymes power using(NH4)2SO4-dialysis-freeze dried method or concentration-dialysis-freeze dried method

2.2 低溫濃縮-透析-凍干-脫脂法與硫酸銨沉淀-透析-凍干-脫脂法提取鴨腸液酶粉劑的消化酶活性與回收率、總蛋白濃度與回收率及化學成分含量的比較

在采用低溫濃縮-透析-凍干法與硫酸銨沉淀-透析-凍干法制備鴨空腸液消化酶粉劑后，發(fā)現(xiàn)粉劑中有明顯的油跡，化學成分測定也得出2種提純方法獲得的粉劑粗脂肪含量在6.6%以上(表2)。因此，對上述2種方法制備的粉劑采用無水乙醇脫脂處理，以求降低粉劑中脂肪的含量，提高消化酶的活性，進一步比較2種粗提純方法的差異。由表3可見，低溫濃縮-透析-凍干-脫脂法制備的粉劑在胰蛋白酶和淀粉酶活性上分別比硫酸銨沉淀-透析-凍干-脫脂法所制備粉劑高7.9%和11.5%(P＜0.05)，而糜蛋白酶的活性差異不顯著(P＞0.05)。低溫濃縮-透析-凍干-脫脂法與硫酸銨沉淀-透析-凍干-脫脂法制備的粉劑在3種消化酶活性的平均變異系數(shù)分別為3.9%與4.2%。在消化酶回收率上，低溫濃縮-透析-凍干-脫脂法制備的粉劑在胰蛋白酶和淀粉酶回收率上分別比硫酸銨沉淀-透析-凍干-脫脂法所制備粉劑高43.9%和39.4%(P＜0.05)，而糜蛋白酶活性回收率差異不顯著(P＞0.05)。低溫濃縮-透析-凍干-脫脂法與硫酸銨沉淀-透析-凍干-脫脂法制備的粉劑中3種消化酶回收率的平均變異系數(shù)分別為9.0%與9.9%。2種粗提純方法制備的粉劑在總蛋白濃度上無顯著性差異(P＞0.05)，但在總蛋白回收率上，低溫濃縮-透析-凍干-脫脂法顯著高于硫酸銨沉淀-透析-凍干-脫脂法(P＜0.05)。在2種方法制備粉劑的化學成分含量的差異上，低溫濃縮-透析-凍干-脫脂法制備的粉劑在粗蛋白質(zhì)及粗灰分含量上顯著低于硫酸銨沉淀-透析-凍干-脫脂法所制備粉劑(P＜0.05)，而2種方法制備的粉劑在粗脂肪含量上無顯著性差異(P＞0.05)。

表3 硫酸銨沉淀-透析-凍干-脫脂法與低溫濃縮-透析-凍干-脫脂法提取鴨空腸液消化酶粉劑的消化酶活性與回收率、總蛋白濃度與回收率及化學成分含量的差異Table 3 Activity and recovery rate of digestive enzyme，concentration and recovery rate of total protein and chemical composition content of duck jejunal digestive enzymes power using(NH4)2SO4-dialysis-freeze dried-defat method or concentration-dialysis-freeze dried-defat method

3 討論

在蛋白質(zhì)純化中，一般采用一定濃度的硫酸銨溶液沉淀目的蛋白質(zhì)，然后通過透析去除硫酸銨及小分子物質(zhì)后，干燥得到目的蛋白質(zhì)的初級提取物。該方法通過沉淀目的蛋白質(zhì)可以快速地去除溶液中的水分及其他物質(zhì)。然而，該方法是通過降低蛋白質(zhì)的溶解度而沉淀蛋白質(zhì)，其水溶液中仍有一部分溶解的目的蛋白質(zhì)被丟棄。特別是在腸液消化酶的純化中，淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的等電點分別處于 4.5 ～4.6［15］、10.1～10.5［7，16］、8.1 ～ 8.6［7，16］，采用中性硫酸銨溶液沉淀酶蛋白時，溶液的pH并不處于各消化酶的等電點，這導(dǎo)致水溶液中目的蛋白質(zhì)的濃度并不是最低值。因此，采用硫酸銨沉淀酶蛋白需要著重考慮回收率能否接受。

這幾年，李敬益和社區(qū)同事在處理矛盾糾紛上又想出了新方法。他們在社區(qū)范圍內(nèi)發(fā)放“彩云社區(qū)無憂卡”和“彩云社區(qū)民情聯(lián)系卡”。這兩張卡的正面是訴求者的基本信息與訴求內(nèi)容，背面是社區(qū)工作人員的手機號碼。

低溫濃縮是對冷凍的樣品在低溫低壓條件下，從凍結(jié)狀態(tài)不經(jīng)過液態(tài)直接升華，達到去除部分水分的目的，然后通過透析去除小分子物質(zhì)后，干燥得到蛋白質(zhì)的初級提取物。該方法只有在透析過程中去除了低分子質(zhì)量的物質(zhì)，而目的蛋白質(zhì)被留在透析袋中，因此，該方法回收率較為理想，但是低溫濃縮過程消耗時間比較長。本試驗在硫酸銨沉淀-透析-凍干-脫脂法與低溫濃縮-透析-凍干-脫脂法制備鴨空腸液消化酶粉劑的過程中，在脫脂前處理的差異上，低溫濃縮-透析-凍干法制備的鴨空腸液消化酶粉劑在3種消化酶粉劑的活性與回收率上均顯著高于硫酸銨沉淀-透析-凍干法。這一結(jié)果與硫酸銨在沉淀酶蛋白時，仍有部分酶蛋白溶解在溶液中的現(xiàn)象相對應(yīng)。硫酸銨沉淀-透析-凍干法制備的鴨空腸液消化酶粉劑在粗灰分與粗蛋白質(zhì)的含量上顯著高于低溫濃縮-透析-凍干法，而兩者總蛋白濃度接近，這表明，硫酸銨沉淀-透析-凍干法制備的粉劑可能存在硫酸銨的殘留。同時，2種方法獲得的粉劑在粗灰分的含量上都很高(10%以上)，這可能是由于透析中無機小分子物質(zhì)去除不理想。脫脂處理后，硫酸銨沉淀-透析-凍干-脫脂法與低溫濃縮-透析-凍干-脫脂法制備粉劑的消化酶活性比脫脂前分別平均提高了34%和17%。這一方面與粉劑中脂肪含量的降低有關(guān);另一方面，由于粉劑中脂肪含量的降低，使得消化酶的水溶性更好，降低了脂肪對消化酶與底物接觸的干擾。脫脂后，2種方法的消化酶回收率均有下降，這說明脫脂過程對消化酶可能有部分破壞作用。在鴨空腸液消化酶提取過程中，低溫濃縮-透析-凍干-脫脂法制備的粉劑在消化酶活性與回收率均比硫酸銨沉淀-透析-凍干-脫脂法高，且變異系數(shù)比硫酸銨沉淀-透析-凍干-脫脂法低。因此，低溫濃縮-透析-凍干-脫脂法在制備鴨空腸液消化酶粉劑的效率上優(yōu)于硫酸銨沉淀-透析-凍干-脫脂法。然而，在粗提純消化酶粉劑的雜質(zhì)含量上，硫酸銨沉淀-透析-凍干-脫脂法與低溫濃縮-透析-凍干-脫脂法中總蛋白濃度占有機物的比例為分別為49%與39%，這也表明硫酸銨沉淀-透析-凍干-脫脂法分離酶蛋白與其他有機物的效果比低溫濃縮-透析-凍干-脫脂法好。在進一步的純化過程中，如粗提純消化酶粉劑的無機物能被分離，則硫酸銨沉淀-透析-凍干-脫脂法獲得的酶蛋白的純度及活性將高于低溫濃縮-透析-凍干-脫脂法。

4 結(jié)論

①低溫濃縮-透析-凍干法制備的消化酶粉劑中，淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性與回收率均顯著高于硫酸銨沉淀-透析-凍干法。

②低溫濃縮-透析-凍干-脫脂法在淀粉酶、胰蛋白酶活性與回收率均顯著高于硫酸銨沉淀-透析-凍干-脫脂法，而在糜蛋白酶的活性與回收率上2種方法間差異不顯著。

教學中把培養(yǎng)和發(fā)展學生的應(yīng)用能力放在首位，抓住課程教學的四要素，即從教學目標、教學內(nèi)容、教學方法和評價方法等方面進行課程教學模式改革，實現(xiàn)教師的教學觀念、方法和學生的學習觀念、方法的轉(zhuǎn)變.

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