應(yīng)用體外發(fā)酵法研究高精料飼糧NSC/NDF與甲烷產(chǎn)量之間的關(guān)系

鄭文思 趙廣永 張婷婷 牛文靜 董瑞蘭

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

反芻動(dòng)物的瘤胃中生活著大量微生物，能夠發(fā)酵飼料中的碳水化合物，產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸(VFA)、甲烷(CH4)、二氧化碳(CO2)和氫氣(H2)。瘤胃內(nèi)的CH4主要是由產(chǎn)甲烷菌利用CO2和H2合成的［1］。瘤胃內(nèi)CH4的產(chǎn)生一方面造成飼料能量損失;另一方面還會(huì)加重地球溫室效應(yīng)。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食和農(nóng)業(yè)組織2006年的統(tǒng)計(jì)，家畜產(chǎn)生的溫室氣體占地球溫室氣體排放量的18%，而其中73%來(lái)自反芻動(dòng)物。反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的CH4占反芻動(dòng)物CH4總產(chǎn)量的90%［2］。準(zhǔn)確預(yù)測(cè)反芻動(dòng)物的CH4產(chǎn)量是降低瘤胃CH4排放的基礎(chǔ)。

飼糧營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)瘤胃CH4產(chǎn)量具有重要影響。據(jù)報(bào)道，飼糧干物質(zhì)采食量(dry matter intake，DMI)［3-5］、能量消化率［6］、非纖維碳水化合物(non-fibre carbohydrate，NFC)、半纖維素和纖維素(cellulose，C)［7］、可消化粗蛋白質(zhì)(digestible crude protein，DCP)、可消化粗脂肪(digestible ether extract，DEE)、可消化粗纖維(digestible crude fiber，DCF)和可消化無(wú)氮浸出物［5］以及代謝能采食量(metabolizable energy intake，MEI)和飼草比例［3］均與反芻動(dòng)物CH4產(chǎn)量之間均存在顯著的相關(guān)關(guān)系。但是，在生產(chǎn)實(shí)際中，應(yīng)用飼糧的營(yíng)養(yǎng)成分或反芻動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)采食量預(yù)測(cè)瘤胃CH4產(chǎn)量并不十分方便。

飼糧精粗比是反映反芻動(dòng)物飼糧特性的重要指標(biāo)。一些研究表明，飼糧精粗比對(duì)瘤胃CH4產(chǎn)量有顯著影響。韓繼福等［8］研究結(jié)果表明，隨著飼糧精料比例(concentrate ratio，CR)的提高，肉牛單位代謝體重的CH4產(chǎn)量下降。Chandramoni等［9］研究結(jié)果表明，隨著飼糧精料比例提高，綿羊的CH4產(chǎn)量下降。精料比例越高，通過(guò)CH4損失的飼料能量比例越低［10］。反芻動(dòng)物飼糧的精料比例一般不高于50%，但在肉?？焖儆孰A段，為了加快肉牛的脂肪沉積，提高牛肉嫩度，在高強(qiáng)度育肥條件下，肉牛飼糧的精料比例可達(dá)80%～100%［11］。

飼料中的結(jié)構(gòu)性碳水化合物(structural carbohydrates，SC)主要包括中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)，非結(jié)構(gòu)性碳水化合物(nonstructural carbohydrates，NSC)主要包括淀粉、可溶性糖和果膠。因此飼糧NSC/NDF可被認(rèn)為是更為準(zhǔn)確的日糧精粗比。本試驗(yàn)擬研究高精料條件下，肉牛飼糧NSC/NDF與體外發(fā)酵CH4產(chǎn)量之間的關(guān)系，闡明根據(jù)飼糧NSC/NDF與CH4產(chǎn)量之間關(guān)系預(yù)測(cè)瘤胃內(nèi)CH4產(chǎn)量的可能性和準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

以2頭年齡為2.5歲、體重約為600 kg，裝有永久性瘤胃瘺管的西門(mén)塔爾去勢(shì)公牛作為瘤胃液供體，拴系飼養(yǎng)。瘤胃液供體牛的日糧組成為:精料 2.0 kg，羊草(Chinese wildrye，CW)6.0 kg。其中精料組成為:玉米58%、豆粕20%、麥麩(wheat bran，WB)18%、磷酸氫鈣2%、食鹽1%、預(yù)混料1%。每天07:00和17:00分2次飼喂，自由飲水。

1.2 試驗(yàn)飼糧和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

應(yīng)用13種肉牛常用飼料為原料，包括精料玉米、豆粕、麥麩、棉籽粕(cottonseed meal，CM)、菜籽粕(rapeseed meal，RM)、次粉(wheat middling，WM)和粗料干酒糟及其可溶物(DDGS)、稻草(rice straw，RS)、麥秸(wheat straw，WS)、玉米秸(corn stover，CS)、谷草(millet straw，MS)、羊草和苜蓿。將風(fēng)干飼料樣品粉碎過(guò)1 mm網(wǎng)篩，用于配制試驗(yàn)飼糧。共設(shè)計(jì) 5個(gè)精粗比(60∶40、70∶30、80∶20和 90∶10 和100∶0)，每個(gè)精粗比設(shè)計(jì) 10 種飼糧，共50種試驗(yàn)飼糧。試驗(yàn)飼糧組成見(jiàn)表1，營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表2。

1.3 體外發(fā)酵

應(yīng)用Menke等［12］的體外產(chǎn)氣法進(jìn)行體外發(fā)酵。應(yīng)用容積為150 mL、可計(jì)量容積為100 mL的玻璃注射器作為發(fā)酵容器，應(yīng)用能夠精確控制溫度的生化培養(yǎng)箱控制培養(yǎng)溫度。

根據(jù)Menke等［12］的方法配制緩沖液。緩沖試劑 A 液:將 CaCl2·H2O 13.2 g、MnCl2·4H2O 10.0 g、CoCl2·6H2O 1.0 g 和 FeCl3·6H2O 8.0 g溶解于蒸餾水中，定容至100 mL;緩沖試劑B液:將NaHCO335.0 g和NH4HCO34.0 g溶解于蒸餾水中，定容至 1 000 mL;緩沖試劑 C液:將Na2HPO45.7 g、KH2PO46.2 g 和 MgSO4·7H2O 0.6 g溶解于蒸餾水中，定容至1 000 mL;還原劑溶液:將 1 N NaOH 20 mL和 Na2S·9H2O 3.125 g溶解于475 mL蒸餾水中。將上述溶液按照下列順序混合:400 mL蒸餾水、0.1 mL A液、200 mL B液、200 mL C液、40 mL還原劑溶液，混合均勻。

試驗(yàn)牛經(jīng)預(yù)飼12 d后，從第13天開(kāi)始采集瘤胃液。在早晨飼喂后2 h，通過(guò)瘤胃瘺管分別從每頭牛瘤胃中采集瘤胃液250 mL左右，使用4層紗布過(guò)濾瘤胃液，并且混合均勻，置于保溫瓶?jī)?nèi)。用pH計(jì)快速測(cè)定瘤胃液pH，然后將瘤胃液與緩沖液以1∶2的體積比例混合均勻，并且持續(xù)通入CO2氣體。

分別稱取0.200 0 g風(fēng)干飼料樣品，放入注射器內(nèi)頂端。每個(gè)飼糧設(shè)置4個(gè)重復(fù)。每個(gè)注射器內(nèi)吸取30 mL培養(yǎng)液。將注射器中的氣體排凈，并密封注射器頂端。將注射器放入39℃的生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵。每批發(fā)酵飼料樣品設(shè)置3個(gè)不含飼料樣品的注射器作為空白對(duì)照。

發(fā)酵持續(xù)進(jìn)行48 h。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，讀取并記錄注射器活塞刻度，以計(jì)算發(fā)酵總產(chǎn)氣量。迅速測(cè)定培養(yǎng)液pH，分別采集5 mL氣體樣品和5 mL發(fā)酵液樣品。向5 mL發(fā)酵液樣品中加入1 mL濃度為25%偏磷酸溶液，在4℃下高速離心(15 000×g)15 min，取上清液置于-20℃的冰箱中保存。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

分別使用 AOAC(1990)［13］的標(biāo)準(zhǔn)方法934.01、920.39和924.05測(cè)定飼料的干物質(zhì)(dry matter，DM)、粗脂肪(ether extract，EE)和粗灰分(ash)含量。應(yīng)用凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白質(zhì)(crude protein，CP)含量。應(yīng)用Van Soest等［14］的方法測(cè)定NDF含量。在測(cè)定NDF含量后，直接測(cè)定飼料的中性洗滌劑殘留物的CP，作為中性洗滌劑不溶粗蛋白質(zhì)(neutral detergent insoluble CP，NDICP)。

使用氣相色譜儀(TP-2060T，北京北分天普儀器有限公司)測(cè)定發(fā)酵氣體中的CH4和CO2產(chǎn)量。測(cè)定條件為:熱導(dǎo)檢測(cè)器(TCD)，TDX-01色譜柱，規(guī)格1 m×2 mm×3 mm，柱溫70℃，檢測(cè)器溫度100℃。載氣為氬氣(He)。標(biāo)準(zhǔn)氣體組成(體積比)為:CH426.796%、CO265.300%、氧氣(O2)0.605%、氮?dú)?N2)7.100%、H20.199%。

表1 試驗(yàn)飼糧組成(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition of experimental diets(DM basis) %

續(xù)表1

表2 試驗(yàn)飼糧的營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 2 Nutrient levels of experimental diets(DM basis)

續(xù)表2

使用氣相色譜儀(TP-2060F，北京北分天普儀器有限公司)測(cè)定發(fā)酵液中的VFA產(chǎn)量。測(cè)定條件為:火焰離子檢測(cè)器(FID)，PEG-20M+H3PO4玻璃柱，柱溫120℃，檢測(cè)器溫度220℃。載氣為 He、H2和空氣，流速分別為 30、30和300 mL/min。每個(gè)樣品取2μL用于分析。標(biāo)準(zhǔn)揮發(fā)性脂肪酸的組成為:乙酸42.0 mmol/L、丙酸32.1 mmol/L、異丁酸 2.0 mmol/L、丁酸14.0 mmol/L、 異戊酸 7.0 mmol/L、戊酸3.0 mmol/L、2-乙基丁酸4.0 mmol/L。其中2-乙基丁酸用作內(nèi)標(biāo)物。

1.5 計(jì)算方法

總 產(chǎn) 氣 量、CH4、CO2、總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)、乙酸、丙酸和丁酸產(chǎn)量計(jì)算方法如下:

式中;Y樣品為樣品的氣體(mL/g)或VFA產(chǎn)量(μmol/g);Y發(fā)酵液為發(fā)酵液的氣體(mL/g)或VFA產(chǎn)量(μmol/g);Y空白為空白的氣體(mL/g)或VFA產(chǎn)量(μmol/g);DM為飼料樣品干物質(zhì)含量(g)。

飼料樣品的碳水化合物(CHO)和NSC含量(%，干物質(zhì)基礎(chǔ))計(jì)算方法如下:

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

應(yīng)用SPSS 16.0分析飼糧精料比與各指標(biāo)間的相關(guān)關(guān)系。分析模型為:y=b x+a(式中，y為體外發(fā)酵指標(biāo)，x為飼糧NSC/NDF)。P＜0.05為相關(guān)關(guān)系顯著，P＜0.01為極顯著。

2 結(jié)果

體外發(fā)酵飼糧樣品的氣體及VFA產(chǎn)量見(jiàn)表3。

2.1 飼糧NSC/NDF與產(chǎn)氣量之間的關(guān)系

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，飼糧NSC/NDF(x，%)與體外發(fā)酵總產(chǎn)氣量(y1，mL/g)、CH4(y2，mL/g)和CO2產(chǎn)量(y3，mL/g)之間均存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)。

2.2 飼糧NSC/NDF與不同發(fā)酵指標(biāo)比例之間的關(guān)系

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，飼糧NSC/NDF比例(x，%)與體外發(fā)酵乙酸/丙酸(y4，%)和 CH4/TVFA(y5，mL/mmol)之間存在極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(P ＜0.01)，但與 CO2/TVFA(y6，mL/mmol)之間的相關(guān)關(guān)系不顯著(P＞0.05)。

3 討論

飼料的SC主要包括NDF，NSC主要包括淀粉、可溶性糖和果膠。因此，考慮到碳水化合物組成，飼糧NSC/NDF可被看作更為精確的飼糧精粗比。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼糧NSC/NDF與體外發(fā)酵總產(chǎn)氣量、CH4、CO2產(chǎn)量以及VFA產(chǎn)量之間均存在顯著正相關(guān)關(guān)系。這說(shuō)明飼糧的可發(fā)酵程度隨著飼糧NSC比例的提高而提高。這與飼糧精料比例與各發(fā)酵指標(biāo)之間的相關(guān)關(guān)系一致。

本試驗(yàn)結(jié)果還顯示，飼糧NSC/NDF與體外發(fā)酵與乙酸/丙酸和CH4/TVFA之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。說(shuō)明隨著飼糧NSC比例的提高，乙酸的比例下降，丙酸的比例提高，即NSC有利于提高丙酸的產(chǎn)量。另外，隨著飼糧NSC比例的提高，CH4的相對(duì)產(chǎn)量下降，這與飼糧精料比例與乙酸/丙酸和CH4/TVFA之間的關(guān)系一致。

需要指出的是，盡管飼糧NSC/NDF與總產(chǎn)氣量、CO2、CH4產(chǎn)量之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，但所有相關(guān)方程的相關(guān)系數(shù)也偏低。造成這一結(jié)果的原因是:1)盡管CH4、CO2是碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生的，但CP、EE和粗灰分等均有可能影響碳水化合物發(fā)酵，進(jìn)而影響發(fā)酵產(chǎn)物CH4、CO2的產(chǎn)量;2)從理論上講，飼糧NSC和NDF含量與體外發(fā)酵指標(biāo)之間存在密切的相關(guān)關(guān)系，但飼糧NSC和NDF含量并不能代表被實(shí)際發(fā)酵的數(shù)量。

Moe等［7］研究表明，奶牛 CH4產(chǎn)量與可溶解殘留物(中性洗滌劑可溶解物-CP-EE)、半纖維素和纖維素采食量之間的決定系數(shù)R2=0.67，而奶牛CH4產(chǎn)量與消化的可溶解殘留物、半纖維素和纖維素之間的決定系數(shù)R2=0.73。Kirchgessner等［15］研究表明，反芻動(dòng)物的飼糧粗纖維、無(wú)氮浸出物、CP和EE采食量與反芻動(dòng)物CH4產(chǎn)量之間的多元決定系數(shù)R2=0.69。Jentsch等［5］研究表明，反芻動(dòng)物DCP、DEE、DCF和可消化無(wú)氮浸出物采食量與反芻動(dòng)物CH4產(chǎn)量之間的多元決定系數(shù)R2=0.896。比較上述結(jié)果可知，可消化營(yíng)養(yǎng)成分與反芻動(dòng)物CH4產(chǎn)量之間的相關(guān)關(guān)系更為密切，因?yàn)榭上癄I(yíng)養(yǎng)成分反映了動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分實(shí)際消化利用的過(guò)程。

NSC/NDF能夠很好地反映飼糧碳水化合物的組成成分，但與瘤胃發(fā)酵總產(chǎn)氣量、CH4、CO2產(chǎn)量以及乙酸/丙酸、CH4/TVFA、CO2/TVFA之間的相關(guān)程度并不高。這可能是因?yàn)镹SC/NDF并不能反映NSC和NDF在瘤胃中的可發(fā)酵程度?？梢酝茰y(cè)，可發(fā)酵NSC/可發(fā)酵NDF比例與瘤胃發(fā)酵總產(chǎn)氣量、CH4、CO2產(chǎn)量以及乙酸/丙酸、CH4/TVFA、CO2/TVFA之間的相關(guān)程度可能更高。因此，這一比例可能更適合作為準(zhǔn)確預(yù)測(cè)飼糧瘤胃發(fā)酵情況的指標(biāo)。

?

4 結(jié)論

高精料飼糧條件下，隨著飼糧NSC/NDF的提高，飼糧體外發(fā)酵的CH4相對(duì)產(chǎn)量下降，但由于相關(guān)系數(shù)偏低，飼糧NSC/NDF不能作為準(zhǔn)確預(yù)測(cè)飼糧體外發(fā)酵CH4產(chǎn)量的唯一指標(biāo)。

［1］?RSKOV E R，RYLE M.Energy nutrition in ruminants［M］.［S.l.］:Elsevier Applied Science，1990.

［2］STEINFELD H，GERBER P，WASSENAAR T，et al.Livestock’s long shadow:environmental issues and options［R］.Rome:Food and Agriculture Organisation of the United Nations，2006.

［3］MILLS J A N，KEBREAB E，YATES C M，et al.Alternative approaches to predicting methane emissions from dairy cows［J］.Journal of Animal Science，2003，81(12):3141-3150.

［4］ELLIS J L，KEBREAB E，ODONGO N E，et al.Prediction of methane production from dairy and beef cattle［J］.Journal of Dairy Science，2007，90(7):3456-3466.

［5］JENTSCH W，SCHWEIGET M，WEISSBACH F，et al.Methane production in cattle calculated by the nutrient composition of the diet［J］.Archives of Animal Nutrition，2007，61(1):10-19.

［6］BLAXTER K L，CLAPPERTON JL.Prediction of the amount of methane produced by ruminants［J］.British Journal of Nutrition，1965，19(1):511-522.

［7］MOE P W，TYRREL H F.Methane production in dairy cows［J］.Journal of Dairy Science，1979，62(10):1583-1586.

［8］韓繼福，馮仰廉，張曉明，等.閹牛不同日糧的纖維消化、瘤胃內(nèi)VFA對(duì)甲烷產(chǎn)生量的影響［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1997，17(3):278-280.

［9］CHANDRAMONI，JADHAO S B，TIWARTI C M，et al.Energy metabolism with particular reference to methane production in Muzaffarnagari sheep fed rations varying in roughage to concentrate ratio［J］.Animal Feed Science and Technology，2000，83(3/4):287-300.

［10］LOVETT D，LOVELL S，STACK L，et al.Effect of forage/concentrate ratio and dietary coconut oil level on methane output and performance of finishing beef heifers［J］.Livestock Production Science，2003，84(2):135-146.

［11］趙廣永.肉牛規(guī)模養(yǎng)殖技術(shù)［M］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2003.

［12］MENKE K H，RAAB L，SALEWSKI A，et al.The estimation of the digestibility and metabolizable energy content of ruminant feeding stuffs from the gas production when they are incubated with rumen liquor in vitro［J］.The Journal of Agricultural Science，1979，93(1):217-222.

［13］AOAC.Official methods of analysis［M］.15th ed.Arlington，V.A.:Association of Official Analytical Chemists，1990.

［14］VAN SOEST P J，ROBERTSON J B，LEWIS B A.Methods for dietary fiber，neutral detergent fiber，and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition［J］.Journal of Dairy Science，1991，74(10):3583-3597.

［15］KIRCHGESSNER M，WINDISCH W，MUELLER H L，et al.Release of methane and of carbon dioxide by dairy cattle［J］.Agrobiological Research，1991，44:91-102.