尿素轉(zhuǎn)運(yùn)因子B影響牛瘤胃尿素氮再循環(huán)的機(jī)制

付 彤 廉紅霞 高騰云 趙衛(wèi)東 孫 宇 李改英

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002)

近年來，反芻家畜肉和奶生產(chǎn)中對(duì)環(huán)境的污染問題日益受到關(guān)注［1］。Meta分析表明，決定奶牛糞污總氮排出的主要因素是飼糧氮攝入量［2］，牛對(duì)飼糧氮的有效利用率只有23%，瘤胃代謝已被確定為反芻動(dòng)物氮利用效率低的最重要原因［3］。瘤胃內(nèi)產(chǎn)生的氨除被微生物用于合成菌體蛋白外，其余的氨經(jīng)消化道上皮吸收入門靜脈，隨血液進(jìn)入肝臟合成尿素。肝臟中產(chǎn)生的尿素91%可通過再循環(huán)重新進(jìn)入消化道內(nèi)［4］，這就形成了反芻動(dòng)物尿素氮的再循環(huán)利用。這種氮的再循環(huán)對(duì)維持反芻動(dòng)物體內(nèi)氮的平衡，尤其是在低氮飼糧條件下具有重要意義。研究表明，低氮飼糧條件下，再循環(huán)至瘤胃的尿素氮顯著增加［5］。探明氮再循環(huán)過程中尿素轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控機(jī)制有利于采取針對(duì)性措施提高不同飼糧和生理?xiàng)l件下反芻動(dòng)物的氮利用［6］。

尿素轉(zhuǎn)運(yùn)因子(urea transporters，UTs)是高選擇性快速通透尿素的膜通道蛋白分子，在牛瘤胃中表達(dá)的尿素轉(zhuǎn)運(yùn)因子B(UT-B)通過參與尿素在瘤胃上皮細(xì)胞(ruminal epithelium cell，REC)中的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，構(gòu)成了牛瘤胃尿素氮再循環(huán)過程的重要部分，對(duì)于維持其氮平衡至關(guān)重要［7］。UT-B介導(dǎo)的經(jīng)上皮細(xì)胞的尿素轉(zhuǎn)運(yùn)是經(jīng)刺激后產(chǎn)生的，且不受已知尿素轉(zhuǎn)運(yùn)因子A(UT-A)調(diào)控因子的影響［8］。由于尿素氮再循環(huán)對(duì)于氮的再利用起關(guān)鍵作用，所以亟待闡明瘤胃發(fā)酵參數(shù)和內(nèi)環(huán)境指標(biāo)對(duì)于反芻動(dòng)物尿素氮再循環(huán)的調(diào)控機(jī)制［9］。為此，本文旨在就UT-B基因?qū)εＡ鑫改蛩氐傺h(huán)的作用機(jī)理進(jìn)行綜述。

1 牛瘤胃尿素氮再循環(huán)

反芻動(dòng)物瘤胃尿素氮循環(huán)是指，瘤胃內(nèi)產(chǎn)生的氨除被微生物用于合成菌體蛋白外，其余的氨經(jīng)消化道上皮吸收入門靜脈，隨血液進(jìn)入肝臟合成尿素。尿素是反芻動(dòng)物體內(nèi)氨和氨基酸代謝的主要終產(chǎn)物。在肝臟中形成的內(nèi)源尿素有3條去路:一部分尿素經(jīng)血液分泌于唾液內(nèi)，隨唾液重新進(jìn)入瘤胃;一部分通過消化道上皮擴(kuò)散進(jìn)入消化道內(nèi);多余的尿素作為廢物排出體外。牛以尿素形式從血液到消化道轉(zhuǎn)運(yùn)循環(huán)利用大量的氮。循環(huán)氮對(duì)總氮具有重要意義。據(jù)報(bào)道，反芻動(dòng)物循環(huán)氮約為飼糧可消化氮的25%［10］。肝臟中合成的尿素有一部分進(jìn)入消化道內(nèi)降解成氨。大部分氨被重新吸收進(jìn)入肝臟以合成尿素，這就形成了反芻動(dòng)物瘤胃尿素氮再循環(huán)利用的機(jī)制(表1和圖1)［11-12］。

表1 不同動(dòng)物種類及人體內(nèi)尿素氮再循環(huán)的動(dòng)態(tài)特征Table 1 Characteristics of urea-N recycling kinetics of different animal species and human［11］ g/d

圖1 反芻動(dòng)物體內(nèi)尿素氮循環(huán)代謝過程Fig.1 Cycling process of urea-N in ruminants［12］

對(duì)于大多數(shù)哺乳動(dòng)物而言，肝臟中合成的尿素氮被轉(zhuǎn)移到胃腸道吸收和利用是一種普遍存在的現(xiàn)象。但對(duì)于牛而言，肝臟中合成的內(nèi)源尿素氮中，40%～80%可通過再循環(huán)重新進(jìn)入消化道內(nèi)，為瘤胃微生物提供氮源，進(jìn)而為宿主動(dòng)物提供氨基酸營養(yǎng)［13］。據(jù)報(bào)道，牛肝臟內(nèi)產(chǎn)生的尿素，隨尿液排出的占33%，進(jìn)入消化道的占67%，后者又有10%隨糞便排出，而尿氮中95%都是尿素［14］。

這種氮的再循環(huán)對(duì)維持反芻動(dòng)物體內(nèi)氮的平衡，尤其是在低氮飼糧條件下具有重要意義［15］。Firkins等［16］對(duì)生長牛和泌乳牛進(jìn)行了315批次檢測(cè)，結(jié)果表明，進(jìn)入門靜脈的氨態(tài)氮的凈吸收量隨著飼糧氮攝入量的增加而升高，二者存在線性回歸關(guān)系，以氨態(tài)氮形式吸收的氮量占飼糧氮攝入量的42%。研究表明，當(dāng)飼喂反芻動(dòng)物低氮飼糧時(shí)，腎臟重新吸收和貯存尿素的能力增加，且進(jìn)入到消化道的尿素清除率加快，尿素氮的循環(huán)利用能力增強(qiáng)，保證了家畜適應(yīng)低氮水平的飼糧［17］。

最近的研究表明，當(dāng)給反芻動(dòng)物連續(xù)間隔1～3 d飼喂不含有蛋白質(zhì)的飼糧與每天飼喂含蛋白質(zhì)飼糧相比，并沒有對(duì)家畜氮的沉積和排泄產(chǎn)生不良影響。而且當(dāng)給反芻動(dòng)物飼喂氮水平不斷變化的飼糧時(shí)氮沉積也會(huì)增加［18］，主要是由于循環(huán)進(jìn)入到瘤胃中的尿素氮能夠提供合成菌體蛋白的氮源，以確保反芻動(dòng)物體內(nèi)正常的氮代謝。

2 UT-B在牛瘤胃尿素氮再循環(huán)中的作用

UTs是高選擇性快速通透尿素的膜通道蛋白分子，介導(dǎo)尿素順濃度梯度的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，首先從兔腎髓質(zhì)成功克?。?9］，其由UT-A(SLC14A2)基因和UT-B(SLC14A1)基因編碼［20］。根據(jù)目前牛的基因組圖譜(NCBI，2013)［21］，牛SLC14A1基因(Gene ID:493988)位于24號(hào)染色體，該基因(GenBank:AY838799.1)大小為27 657 bp，包含10 個(gè)外顯子［22］。

近年來，UTs的研究主要集中在腎臟，其在尿液濃縮中的關(guān)鍵作用［23］已被探明。UT-B廣泛表達(dá)于腎臟、心臟、腦等組織器官，且在多個(gè)物種的胃腸道均有表達(dá)，包括:鼠［24］、人［25］、綿 羊［26］和牛［27］。

UTs對(duì)于胃腸道中尿素氮的再循環(huán)過程起著關(guān)鍵的調(diào)控作用［11］。Simmons等［7］以利木贊雜交牛為對(duì)象通過免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)瘤胃上皮層存在UT-B，UT-B對(duì)于進(jìn)入到胃腸道的尿素起關(guān)鍵作用。Stewart等［27］在牛的瘤胃中檢測(cè)到3.7 kb的UT-B基因，其對(duì)肝臟合成的尿素進(jìn)入瘤胃起著關(guān)鍵作用，UT-B存在2個(gè)拼接變異體:UT-B1和UT-B2，其中UT-B2是牛瘤胃中的主要形式。因此，UT-B介導(dǎo)牛瘤胃中尿素的轉(zhuǎn)運(yùn)，構(gòu)成了牛瘤胃尿素氮再循環(huán)過程的重要機(jī)制，對(duì)于維持其氮平衡至關(guān)重要［7］。體外研究表明，短時(shí)間(90 min)培養(yǎng)條件下，瘤胃上皮細(xì)胞和十二指腸黏膜細(xì)胞(duodenal mucosal cells，DMC)可合成尿素［28］。

3 瘤胃UT-B基因啟動(dòng)的影響因素

UT-B介導(dǎo)的經(jīng)上皮細(xì)胞的尿素轉(zhuǎn)運(yùn)是經(jīng)刺激后產(chǎn)生的，且不受已知UT-A調(diào)控因子的影響［8］。目前，關(guān)于反芻動(dòng)物UT-B調(diào)控因子的研究認(rèn)為:飼糧氮水平及瘤胃發(fā)酵參數(shù)和內(nèi)環(huán)境指標(biāo)［如揮發(fā)性脂肪酸(VFA)、氨態(tài)氮等的濃度］調(diào)控反芻動(dòng)物瘤胃尿素氮轉(zhuǎn)運(yùn)，但因畜種、研究條件等不同，研究結(jié)果并不一致，由于尿素氮再循環(huán)對(duì)于氮的再利用起關(guān)鍵作用，亟待闡明瘤胃發(fā)酵參數(shù)和內(nèi)環(huán)境指標(biāo)對(duì)于反芻動(dòng)物瘤胃尿素氮再循環(huán)的調(diào)控機(jī)制［9］。

3.1 飼糧氮水平對(duì)瘤胃UT-B基因的影響

Tickle等［8］以犬腎細(xì)胞系(MDCK)為對(duì)象研究認(rèn)為，UT-B2介導(dǎo)的經(jīng)上皮細(xì)胞的尿素轉(zhuǎn)運(yùn)為組成性激活，且不受已知的腎臟UT-A調(diào)控因子，如細(xì)胞內(nèi)環(huán)化腺苷酸(cAMP)、鈣(Ca)及蛋白激酶活性等的影響。

研究表明，牛瘤胃UT-B表達(dá)水平受飼糧的調(diào)控［7］。其中，飼糧氮攝入水平可改變牛瘤胃UT-B mRNA 表達(dá)豐度和 UT-B 表達(dá)水平［15，29］。且隨著飼糧中瘤胃降解蛋白(rumen degradable protein，RDP)的添加，瘤胃腹囊N-糖基化UT-B的表達(dá)水平提高，表明UT-B可能對(duì)尿素的排出起關(guān)鍵作用，而非尿素到胃腸道的再循環(huán)［26］。

3.2 瘤胃發(fā)酵參數(shù)和內(nèi)環(huán)境指標(biāo)對(duì)瘤胃尿素氮轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

3.2.1 CO2

Thorlacius等［30］首次通過培養(yǎng)分離的瘤胃組織證實(shí)了CO2對(duì)經(jīng)瘤胃的尿素氮轉(zhuǎn)運(yùn)有刺激效應(yīng)。Abdoun等［31］利用尤斯灌流(Ussing chamber)方法離體培養(yǎng)瘤胃上皮組織表明，隨著CO2供給量增加，經(jīng)瘤胃上皮轉(zhuǎn)運(yùn)的尿素氮量亦增加;與pH為7.4時(shí)相比，當(dāng)pH為6.4時(shí)尿素氮的轉(zhuǎn)運(yùn)量增加最多。就目前關(guān)于CO2對(duì)瘤胃尿素氮轉(zhuǎn)運(yùn)的影響而言，均是采用體外技術(shù)進(jìn)行研究，雖然有證據(jù)表明CO2對(duì)瘤胃尿素氮轉(zhuǎn)運(yùn)存在影響，但其是否受UT-B基因調(diào)控，尚有待于進(jìn)一步在活體試驗(yàn)中加以探明［30-31］。

3.2.2 VFA濃度和pH

Abdoun等［31］離體研究表明，當(dāng)黏膜 pH從7.4降至5.4時(shí)，從漿膜至黏膜的尿素氮轉(zhuǎn)運(yùn)量呈鐘形曲線，當(dāng)pH為6.0～6.4時(shí)，尿素氮的轉(zhuǎn)運(yùn)率最高;體試驗(yàn)表明，pH為6.0～6.4時(shí)，改變瘤胃因子(如VFA濃度)對(duì)再循環(huán)至瘤胃的尿素氮有顯著影響。

瘤胃VFA，特別是丁酸濃度，對(duì)經(jīng)瘤胃的尿素氮轉(zhuǎn)運(yùn)有刺激效應(yīng)。Simmons等［7］研究表明，與飼喂青貯型飼糧相比，飼喂精料型飼糧的利木贊雜交牛瘤胃UT-B2 mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)水平均較高，且瘤胃丁酸水平亦較高(11.7%的總VFA中9.3%為丁酸)?？梢?，丁酸可能影響了UT-B2的表達(dá)，進(jìn)而提高了進(jìn)入瘤胃的尿素氮。

而 Oba等［32］對(duì)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞進(jìn)行了90 min的體外培養(yǎng)，結(jié)果表明，VFA濃度及丙酸乙酸比未對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞尿素合成產(chǎn)生影響;精氨酸增加了瘤胃上皮細(xì)胞尿素的合成。

目前，關(guān)于反芻動(dòng)物瘤胃尿素氮再循環(huán)的調(diào)控因子的研究認(rèn)為:飼糧氮水平及瘤胃發(fā)酵參數(shù)和內(nèi)環(huán)境指標(biāo)(如VFA、氨態(tài)氮濃度等)調(diào)控反芻動(dòng)物瘤胃尿素氮轉(zhuǎn)運(yùn)，但研究結(jié)果并不一致，由于尿素氮再循環(huán)對(duì)于氮的再利用起關(guān)鍵作用，所以亟待闡明瘤胃因子對(duì)于反芻動(dòng)物瘤胃尿素氮再循環(huán)的調(diào)控機(jī)制［9］。

4 小結(jié)

UT-B在牛瘤胃尿素氮轉(zhuǎn)運(yùn)中起關(guān)鍵作用，對(duì)于提高牛對(duì)飼糧氮的有效利用率具有重要意義，其基因表達(dá)受飼糧氮水平和瘤胃發(fā)酵參數(shù)及內(nèi)環(huán)境指標(biāo)等因素影響。UT-B對(duì)于牛瘤胃尿素氮再循環(huán)的具體調(diào)控機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

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