不同因素對高溫脫脂豆粕蛋白提取率的影響

劉明美 齊 斌 趙國琦 張文豪 朱偉成

(1.揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009;2.江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院淮安生物工程分院，淮安 223200;3.常熟理工學(xué)院，蘇州 215500)

被譽(yù)為“綠色牛奶”、“植物肉”的大豆蛋白是一種可與動物蛋白相媲美的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，目前國內(nèi)外主要以蛋白質(zhì)變性程度較低的低溫脫脂豆粕為原料，通過堿溶酸沉法提?。?-3］。而占國內(nèi)豆粕產(chǎn)量90%以上的高溫脫脂豆粕經(jīng)高溫處理后，一方面，因豆粕內(nèi)大部分的不耐熱抗?fàn)I養(yǎng)因子活性被降低或滅活，從而更有利于動物對蛋白質(zhì)的消化吸收和利用;另一方面，豆粕蛋白變性嚴(yán)重，不利于蛋白提取，主要用作畜禽飼料，從而大大限制了高溫脫脂大豆粕深加工產(chǎn)品的開發(fā)及應(yīng)用。近年來，國內(nèi)外雖然開展了利用高溫脫脂豆粕生產(chǎn)醇洗濃縮蛋白［4］、酶解［5］或超聲提取蛋白［6-7］等研究，但缺少對影響其蛋白提取率各因素的系統(tǒng)研究，從而無法較為全面地確定高溫脫脂豆粕蛋白提取的最佳條件。為此，我們在前人研究基礎(chǔ)上，通過單因素和正交試驗設(shè)計，采用傳統(tǒng)的堿溶酸沉與超聲輔助技術(shù)相結(jié)合的方法，對影響蛋白提取率的提取溫度、超聲時間、pH、粉碎細(xì)度、水料比、超聲功率、提取時間7因素進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并優(yōu)化了高溫脫脂豆粕的大豆蛋白提取條件，以期為高溫脫脂豆粕進(jìn)行深加工，開發(fā)其更大、更廣的利用價值提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

高溫脫脂豆粕(粗蛋白質(zhì)含量為51.96%):吉林豐正大豆食品有限公司;三蒸水:實驗室自制;考馬斯亮藍(lán)試劑盒:南京建成生物工程研究所;HCl與NaOH:分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器;FS-6D型大流水式粉碎機(jī);賽多利斯PB-21型酸度計;SHA-C型恒溫水浴鍋;FA2004型分析天平;Anke低速大容量離心機(jī);756型分光光度計;DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱;SZ-97型自動三重純水蒸餾器。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 單因素試驗設(shè)計

在單因素試驗中，分別研究了提取溫度、超聲時間、pH、粉碎細(xì)度、水料比、超聲功率、提取時間對高溫脫脂豆粕蛋白提取率的影響。各因素設(shè)置水平如下:提取溫度，20、30、40、50、60、70 ℃;超聲時間，0、5、10、15、20、30 min;pH，8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5;粉碎細(xì)度，0(未粉碎)、40、60、80、100、120 目;水料比，5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1(mL/g);超聲功率，0、200、300、400、500 W;提取時間，15、30、45、60、90 min。各因素的每個水平設(shè)3個重復(fù)。測定某一因素時其他因素為非測定因素，預(yù)試驗選擇非測定因素的水平為提取溫度50℃、超聲時間15 min、pH 10.0、粉碎細(xì)度80目、水料比15∶1(mL/g)、超聲功率 400 W、提取時間60 min(超聲+水浴震蕩)。

1.3.2 正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，設(shè)計出7因素3水平正交試驗(表1)，設(shè)3個重復(fù)。

表1 L18(3)7正交試驗設(shè)計Table 1 L18(3)7 orthogonal design

1.4 大豆蛋白的提取與測定方法

準(zhǔn)確稱取經(jīng)去雜、粉碎等預(yù)處理的高溫脫脂豆粕1 g，按比例加入三蒸水，調(diào)節(jié)其pH，在一定溫度下經(jīng)不同功率不同超聲時間處理后，恒溫水浴振蕩提取一定時間，通過滴加1 mol/L NaOH或HCl溶液保持液料pH在提取過程中不變。浸提后離心(4 000 r/min，20 min)，收集上清液，考馬斯亮藍(lán)法測定上清液的蛋白質(zhì)含量。

凱氏定氮法測定試驗材料高溫脫脂豆粕中的粗蛋白質(zhì)含量［8］。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)通過Excel 2007整理后，采用SPSS 16.0單因素方差分析(one-way ANOVA，LSD)，以P＜0.05作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 單因素提取條件對蛋白提取率的影響

在其他6個因素相對固定的條件下，分別測定了不同水平的某一因素對大豆蛋白提取率的影響，結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，各粉碎組的豆粕蛋白提取率顯著高于未粉碎組(P＜0.05)，其中80目組的蛋白提取率顯著高于其他各組(P＜0.05)，較0、40、60目組的蛋白提取率分別提高了83.81%、40.46%和17.43%;粉碎細(xì)度高于80目后，蛋白提取率卻出現(xiàn)下降趨勢。在本試驗設(shè)置的pH范圍內(nèi)，隨著pH的增加，大豆蛋白提取率升高，其中pH 10.5組的蛋白提取率比pH 8.0組提高了38%，差異顯著(P＜0.05)。提取溫度小于50℃時，蛋白提取率隨著提取溫度升高而顯著增加(P＜0.05);但當(dāng)提取溫度高于50℃后，蛋白提取率增加減緩，隨著提取時間組的延長，蛋白提取率逐漸上升，但差異不顯著(P＞0.05)。水料比為 20∶1組的蛋白提取率比 5∶1組提高了21.39%，顯著高于水料比為 5∶1、10∶1、15∶1 組的蛋白提取率(P＜0.05)。超聲組的大豆蛋白提取率都顯著高于未超聲組(P＜0.05)，但不同超聲時間組的差異卻不顯著(P＞0.05)，超聲時間5 min組的大豆蛋白提取率比未超聲組提高了29.76%。超聲功率在0～300 W范圍內(nèi)時，隨著超聲功率的提高，蛋白提取率增加，超聲功率300 W組的提取率比未超聲組提高了8.24%，超聲功率400、500 W組的蛋白提取率稍微下降，但差異不顯著(P＞0.05)。

表2 單因素提取條件對蛋白提取率的影響Table 2 Effects of single factor extraction condition on protein extraction rate %

2.2 正交試驗

通過SPSS 16.0軟件對正交試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，輸出的數(shù)據(jù)較多，從中節(jié)選部分列出。由表3可以看出，在本試驗選擇的7個因素中，超聲功率和提取時間對高溫脫脂豆粕蛋白提取率的影響顯著，其他因素影響不顯著(P＞0.05);各因素影響依次是:提取時間＞超聲功率＞水料比＞超聲時間＞粉碎細(xì)度＞提取溫度＞pH。

以大寫字母分別代表下列各因素:提取溫度(A)、超聲時間(B)、pH(C)、粉碎細(xì)度(D)、水料比(E)、超聲功率(F)、提取時間(G)，綜合表4和表5可以看出:A3平均值(45.144)最大，A3＞A2＞ A1，但 A1、A2、A3之 間差異不顯 著(P ＞0.05);同理，可以通過另外幾張表格的分析得出:B2平均值(45.631)最大，B2＞ B3＞ B1，但 B1、B2、B3之間差異不顯著(P＞0.05);C2平均值(44.706)最大，C2＞ C3＞ C1，但 C1、C2、C3之間差異不顯著(P＞0.05);D3平均值(45.690)最大，D3＞D2＞ D1，但 D1、D2、D3之間差異不顯著(P ＞0.05);E3平均值(46.201)最大，E3＞E2＞E1，但E1、E2、E3之間差異不顯著(P ＞0.05);F3平均值(48.173)最大，F(xiàn)3＞F1＞F2，且 F1與 F2之間差異不顯著(P＞0.05)，F(xiàn)3與 F2、F1之間差異顯著(P＜0.05);G2平均值(47.415)最大，G2＞G3＞G1，且 G1與 G2、G3之間差異顯著(P ＜0.05)，但G2與G3之間差異不顯著(P＞0.05)。

表3 正交試驗方差分析表(因變量∶提取率)Table 3 The analysis of variance table of orthogonal experiment(dependent variable∶extractive rate)

表4 單因素統(tǒng)計量表(提取溫度∶提取率)Table 4 The statistics table of single factor(extractive temperature∶extractive rate)

表5 配對比較表(因變量∶提取率)Table 5 Pair-wise comparisons table(dependent variable∶extractive rate)

3 討論

3.1 單因素提取條件對蛋白提取率的影響

3.1.1 粉碎細(xì)度對大豆蛋白提取率的影響

李寶山等［9］試驗表明，60和80目高溫脫脂豆粕的蛋白提取率分別是39.82%和44.95%。一般來說，豆粕粉碎越細(xì)，其細(xì)胞壁被破壞越嚴(yán)重，且相同質(zhì)量豆粕的表面積越大，從而與提取溶劑接觸的面積也就越大，越有利于蛋白的提取;但粉碎過細(xì)會增加過濾和漿渣分離的難度，反而影響蛋白得率。本試驗結(jié)果表明，粉碎細(xì)度為80目組的高溫脫脂豆粕的蛋白提取率最高，分別比0、40、60目組提高了83.81%、40.46%和17.43%;但超過80目后的提取率卻有所降低。

3.1.2 水料比對大豆蛋白提取率的影響

水料比是影響大豆蛋白提取率的另一重要因素。鄭田要等［10］通過試驗發(fā)現(xiàn)，料水比為1∶30(g/mL)、pH為10.0、熱水處理時間20 min時的高溫豆粕蛋白溶出率可達(dá)59.03%。一般來說，加水量過少，堿提液濃度高，體系黏度大，蛋白不易溶出;但隨著加水量的增加，蛋白溶出率卻會趨于平衡。本試驗結(jié)果也證實了這一點(diǎn)。

3.1.3 pH對大豆蛋白提取率的影響

堿液可使豆粕緊密結(jié)構(gòu)變得疏松，促進(jìn)結(jié)合物與蛋白分離，提高蛋白提取率，因此，理論上講，在一定堿性范圍內(nèi)，pH越高，蛋白溶出率越高;但堿性過強(qiáng)會引起蛋白質(zhì)極端變性，產(chǎn)生有毒物質(zhì)，且部分蛋白質(zhì)會發(fā)生水解，生成低分子量、低密度產(chǎn)品，以乳清形式流失，反而使蛋白得率下降。因此，綜合考慮豆粕大豆蛋白質(zhì)的提取率和提取蛋白的質(zhì)量，本試驗將pH設(shè)定在8.0～10.5之間，并證實了pH為10.5時，蛋白提取率最高，高達(dá)56.97%，是pH為8.0時的1.38倍。這與鄭田要等［10］的試驗結(jié)果相似。

3.1.4 提取溫度和時間對大豆蛋白提取率的影響

車康等［11］通過試驗發(fā)現(xiàn)，在55～75℃提取溫度內(nèi)，65℃時的高溫豆粕蛋白提取率最高。本試驗結(jié)果也表明，提取溫度50℃時的蛋白提取率在20～70℃內(nèi)最高。究其原因可能是:當(dāng)提取溫度較低時，增加提取溫度可以促進(jìn)分子運(yùn)動，從而有助于蛋白的浸出;但當(dāng)溶出率達(dá)到最大值后，繼續(xù)提高提取溫度一方面可能增加了水分蒸發(fā)，致使水料比下降，另一方面可能是提取溫度過高時蛋白質(zhì)熱變性程度增加，引起蛋白質(zhì)聚集，從而使蛋白質(zhì)的溶解度下降，最終從而導(dǎo)致大豆蛋白提取率下降。

大豆蛋白要從高溫豆粕中溶出，需要與溶劑進(jìn)行充分的接觸，因此，在一定時間范圍內(nèi)，浸提時間越長，越利于豆粕蛋白的浸出，但超過一定時間后，隨著時間的延長蛋白溶出率趨于平衡，提取率就不再增加。本試驗結(jié)果表明，堿提時間為45 min時的蛋白提取率最高。這與車康等［11］的試驗結(jié)果一致。

3.1.5 超聲時間和功率對大豆蛋白提取率的影響

超聲波因具有成本低、設(shè)備簡單、操作容易、提取率高等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于目的物質(zhì)的強(qiáng)化提取。李寶山等［6］將高溫粕分別進(jìn)行了先粉碎后超聲、先超聲后粉碎和直接粉碎處理后提取大豆蛋白，結(jié)果表明，其大豆蛋白提取率分別為55.21%、53.46%和36.21%。楊曉泉等［7］研究發(fā)現(xiàn)用300 W、12 Hz低頻超聲處理8 min，高溫脫脂豆粕的蛋白浸出率為73.43%，而45℃加熱攪拌提取1 h，高溫脫脂豆粕的蛋白浸出率僅為49.58%。本試驗發(fā)現(xiàn)，0～500 W內(nèi)的超聲功率，300 W超聲處理的大豆蛋白提取率最高;超聲時間為0～30 min時，20 min超聲處理的大豆蛋白提取率最高。這可能與其能促使溶劑更大程度的滲入細(xì)胞中，從而提高物質(zhì)傳遞及破裂細(xì)胞壁便于目的物質(zhì)釋放等有關(guān)［12］。

3.2 篩選最佳提取條件

蛋白質(zhì)在用堿處理或加熱時會生成賴丙氨酸［13］，而試驗表明賴丙氨酸可使大鼠腎臟產(chǎn)生病變(肥大)，腎小管細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核增大［14］，且細(xì)胞癌變前期也是細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核的肥大［15］。因此，為避免高溫、高pH致使大豆蛋白提取過程中有毒物質(zhì)賴丙氨酸的生成，同時考慮較高提取率的獲得，在前面單因素試驗基礎(chǔ)上，我們將正交試驗中的提取溫度設(shè)為40、45、50℃ 3個水平，pH設(shè)為9.0、9.5、10.0 3個水平。這可能是本試驗蛋白提取率低于車康等［11］超聲波法及鄭田要等［10］熱壓法提取率的原因之一;而高溫豆粕加工工藝不同，受熱變性程度不同，提取率也就必然會存在差異，這可能是本試驗中提取率較低的原因之二。

正交試驗的直觀分析法存在一定的局限性，不能估計試驗過程及試驗結(jié)果測定中必然存在的誤差，因而不能區(qū)分某因素各水平所對應(yīng)的試驗結(jié)果的差異究竟是由于水平的改變所引起的，還是由試驗誤差所引起的。因此，我們通過SPSS 16.0軟件對正交試驗結(jié)果進(jìn)行了方差分析，并得出結(jié)果:超聲功率和提取時間對高溫脫脂豆粕蛋白提取率的影響極為顯著，其他因素影響不顯著。各因素影響大小順序依次是:提取時間＞超聲功率＞水料比＞超聲時間＞粉碎細(xì)度＞提取溫度＞pH。

4 結(jié)論

①在一定范圍內(nèi)，高溫脫脂豆粕的蛋白提取率隨著各因素設(shè)置水平的提高而提高。

②各因素對大豆蛋白提取率影響依次是:提取時間＞超聲功率＞水料比＞超聲時間＞粉碎細(xì)度＞提取溫度＞pH。

③從節(jié)約、提高蛋白提取率及盡可能減少或避免有毒物質(zhì)生成等角度出發(fā)，高溫脫脂豆粕蛋白提取的最優(yōu)條件組合為:提取時間45 min，超聲功率 500 W，水料比 25∶1(mL/g)，超聲時間15 min，粉碎細(xì)度60目，提取溫度45℃，pH 9.0。

［1］陳姿含，管驍，李景軍.響應(yīng)面法優(yōu)化低溫豆粕大豆分離蛋白提取工藝［J］.生物加工過程，2012，10(3):39-44.

［2］鐘瑜，周歡，陳禮剛.大豆蛋白提取工藝初探［J］.輕工科技，2012(5):4-7.

［3］張杰，王振斌，王世清，等.超聲輔助堿提大豆蛋白工藝研究［J］.大豆科學(xué)，2010，29(3):498-501.

［4］劉玉蘭，汪學(xué)德，丁莉.利用高溫豆粕生產(chǎn)醇洗大豆?jié)饪s蛋白的研究［J］.中國油脂，2007，32(11):36-39.

［5］劉芳，王遂.酶法提取變性脫脂豆粕中蛋白質(zhì)的研究［J］.食品科學(xué)，2004，25(3):89-92.

［6］李寶山，王際英，張利民，等.超聲波對大豆分離蛋白提取率及性質(zhì)的影響［J］.飼料研究，2008(5):1-3.

［7］楊曉泉，熊犍，陳中，等.低頻超聲對豆粕蛋白浸出率及SPI功能特性的影響［J］.華南理工大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2003，31(11):30-32，36.

［8］張麗英.飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.

［9］李寶山，王際英，張利民，等.不同處理對大豆?jié)饪s蛋白(SPC)粗蛋白含量及提取率的影響［J］.飼料與畜牧，2009(3):25-27.

［10］鄭田要，楊曉泉.熱壓法提取高溫大豆粕中的大豆蛋白［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35(8):175-178.

［11］車康，謝微，汪春，等.利用高溫脫脂豆粕制備脫脂豆?jié){工藝的研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(17):204-207.

［12］韓國軍，孫艷娟，韓麗娟.超聲波對豆粕的影響［J］.長春師范學(xué)院學(xué)報，2002，21(2):55-56.

［13］PIVA G，MOSCHINI M，F(xiàn)IORENTINI L，et al.Effect of temperature，pressure and alkaline treatments on meat meal quality［J］.Animal Feed Science and Technology，2001，89(1/2):59-68.

［14］WOODARD J C，SHORT D D.Renal toxicity of nε-(DL-2-amino-2-carboxyethyl)-L-lysine (lysinoalanine)in rats［J］.Food and Cosmetics Toxicology，1977，15(2):117-119.

［15］MARMOT M，ATINMO T，BYERS T，et al.Food，nutrition，physical activity，and the prevention of cancer:a global perspective［R］.Washington，D.C.:World Cancer Research Fund and American Institute for Cancer Research，2007.