不同鋅源對肉雞組織鋅含量、酶活性、金屬硫蛋白含量及其基因相對表達量的影響

劉化偉，劉大森，鄭立鑫，石汝彬

（東北農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，哈爾濱 150030）

鋅是機體必需的微量元素，參與機體300多種酶和功能蛋白的組成，對動物的生長與發(fā)育具有重要作用[1-2]。目前，在飼料中常用的鋅源主要包括無機鋅和氨基酸螯合鋅兩類，但針對氨基酸螯合鋅和無機鋅在吸收利用率上的研究結果各不相同。相關研究在不同動物試驗中指出氨基酸螯合鋅的吸收利用率優(yōu)于無機鋅[3-6]。Hill和Pimentel等分別在豬和肉雞的試驗中指出氨基酸螯合鋅和無機鋅在吸收利用率上無顯著差異[7-8]。造成氨基酸螯合鋅吸收效果不同的主要原因是沒有考慮飼料復雜因素干擾、試驗動物的不同、產(chǎn)品質量的差異和吸收機制不明確等原因，且研究多集中于蛋氨酸鋅與硫酸鋅間比較，對于多種鋅源間的比較研究則相對較少。因此，本試驗選擇市場常見的2種氨基酸螯合鋅與2種無機鋅，通過飼喂相同水平不同鋅源的半純合飼糧，排除飼糧因素干擾，研究氨基酸螯合鋅對肉雞血液和組織中鋅含量、肝臟和胰臟金屬硫蛋白（Metallothionein,MT）含量、肝臟相關酶活性及十二指腸黏膜金屬硫蛋白基因相對表達的影響。比較4種鋅源在AA肉仔雞中的作用效果，為肉仔雞鋅添加劑在生產(chǎn)實踐中的選擇和應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗選用2種無機鋅：硫酸鋅（ZnSO4·7H2O，購自天津博迪化工有限公司），其中ZnSO4含量不小于99.50%、鋅含量40.03%；氧化鋅（ZnO，購自天津基準化學試劑有限公司），ZnO含量不小于99.00%、鋅含量80.33%。2種氨基酸螯合鋅：蛋氨酸鋅（ZnMet），ZnMet含量不小于79.00%、鋅含量17.50%；賴氨酸鋅（ZnLys），ZnLys含量不小于58.00%、鋅含量10.50%。2種螯合鋅均由廣東天科有限公司提供。

1.2 設計

試驗選100只1日齡AA肉公雞，采用單因子完全隨機設計，共設4個處理組，分別為：氧化鋅組、硫酸鋅組、賴氨酸鋅組、蛋氨酸鋅組。每組5個重復，每個重復5只雞。肉雞在1～13日齡期間飼喂含飼料級一水硫酸鋅的玉米-豆粕型飼糧（鋅含量100 mg·kg-1）保證仔雞健康成長。14～21日齡飼喂缺鋅玉米-豆粕日糧（鋅含量22.61 mg·kg-1），使肉仔雞臨界缺鋅狀態(tài)，以提高肉仔雞對不同形態(tài)鋅吸收的敏感性，1～21日齡自由采食和飲水。22～28日齡飼喂充足含不同鋅源的4種半純合日糧（鋅含量90 mg·kg-1），22～28日齡自由采食和飲用去離子水，24 h恒定光照。1～28日齡日糧見表1。參照美國NRC（1994）[9]肉仔雞的營養(yǎng)需要量配制 基礎飼糧。飼養(yǎng)管理按《AA肉仔雞飼養(yǎng)管理手冊》進行。

1.3 樣品采集與制備

試驗結束，從各組每個重復選1只雞，翅靜脈采血10 mL左右于肝素鈉管中，3 000 r·min-1離心10 min，分離血清，貯存于1.5 mL EP管中-20℃保存待分析用。采血后將肉雞頸部放血，剝皮，快速解剖分離肝臟、胰腺、胸肌、腿肌及脛骨，各組織分別放入液氮速凍后于-80℃保存待測。取十二指腸腸段，外翻后，用冰的滅菌生理鹽水沖洗，再用滅菌的載玻片刮下十二指腸的小腸粘膜，將其置于滅菌的1.5 mL的離心管中，液氮凍存，以備檢測MT mRNA的相對表達量。

表1 基礎日糧組成及營養(yǎng)水平Table1 Composition and nutrients level of basal diet(%)

1.4 測定指標與方法

1.4.1 血液及組織鋅含量測定

試驗中所用玻璃器皿提前用5%硝酸浸泡去除離子干擾。脛骨先用去離子水沖洗干凈，然后煮沸，剝除外層附著物，再用去離子水沖洗后于600℃下灰化至恒重備用。組織處理采用濕灰化法，稱取1 g肝、胰或脛骨，分別加入5 mL混合酸（濃硝酸∶高氯酸=4∶1），消化過夜后蓋上表面皿，置于電熱板上消煮至澄清透明，待冷卻后用超純水定容至100 mL容量瓶中。取1 mL血清，加入5 mL混合酸，消煮后定容至50 mL。用火焰原子吸收光譜儀（儀器型號TAS-986、工作站版本AAWin V1.2）測定樣品鋅含量，鋅標準溶液購于國家標準物質中心。

1.4.2 組織MT含量測定

用鎘血紅蛋白親和力分析方法[10]測定肝臟、胰腺中MT含量，測定用牛血紅蛋白購自Sigma公司，鎘標準液由國家標準物質中心提供，使用儀器為火焰原子吸收光譜儀。

1.4.3 肝臟酶活性的測定

肝臟中堿性磷酸酶、銅鋅超氧化物歧化酶、谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶和乳酸脫氫酶活性均由南京建成提供的試劑盒測定，具體操作步驟按說明書進行。

1.4.4 十二指腸黏膜MT mRNA表達量測定

按照RNA提取試劑盒說明書（百泰克公司）抽提總RNA，利用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量和濃度（OD260/280=1.8-2.0）。檢測后的總RNA立即進行反轉錄，-80℃冰箱中保存待用。

根據(jù)GenBank中檢索到的肉雞看家基因β-actin和MT基因序列（NM_205518）、（NM_205275）設計引物，β-actin上游引物：5'GAGAAATTGTGCG TGACATCA 3'，下游引物:5'CCTGAACCTCTCAT TGCCA 3'。MT上游引物：5'ACTTGTGCTGCT GGTGACTC 3'，下游引物：5'GCTTTTCGTGG TCCCTGTC 3'。引物均由上海生物工程有限公司合成。

RNA反轉錄反應使用High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits（Applied Biosystems）試劑盒，采用20 μL反應體系，進行反轉錄。

real-Time PCR反應按照大連寶生物公司的SYBR real-Time PCR Kit試劑盒進行。反應體系為：SYBR?Premix Ex TaqTM（2×）10.0 μL，PCR Forward Primer（10 μmol·L-1）0.4 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol·L-1）0.4 μL，ROX Reference Dye II（50×）0.4 μL，d H2O（滅菌蒸餾水）6.8 μL，cDNA模板2 μL，共20 μL。將目的基因和看家基因在同一板中進行反應（見表2），采用2-△ct進行相對定量。

表2 實時熒光定量PCR反應的程序設置Table2 Program settings of Real-time fluorescent quantitative PCR

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用SAS9.13軟件進行方差分析和多重比較，結果以平均值±標準誤表示，以P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同鋅源對血液和其它組織鋅含量的影響

不同鋅源對肉雞血液和組織鋅含量影響見表3。

氨基酸螯合鋅（ZnMet、ZnLys）處理組血液、肝臟和脛骨鋅含量顯著高于無機鋅（ZnSO4、ZnO）處理組（P ＜0.05），各無機鋅（ZnSO4、ZnO）處理組和氨基酸螯合鋅（ZnMet、ZnLys）處理組之間無顯著差異（P＞0.05）。不同鋅源處理組對胰臟、胸肌和腿肌影響不大，無顯著差異（P＞0.05）。

表3 不同鋅源對血液和其他組織鋅含量的影響Table3 Effects of different Zn source on broiler'blood Zn and other organization Zn concentration

2.2 不同鋅源對肝臟和胰臟金屬硫蛋白含量的影響

不同鋅源對肉雞肝臟、胰臟金屬硫蛋白含量影響見表4。氨基酸螯合鋅（ZnMet和ZnLys）處理組和無機鋅（ZnSO4、ZnO）處理組對肝臟和胰臟金屬硫蛋白影響不大，并無顯著差異（P＞0.05）。

2.3 不同鋅源對肝臟酶活性的影響

不同鋅源對肉雞肝臟酶活性影響見表5。

氨基酸螯合鋅（ZnMet、ZnLys）處理組肝臟中的銅鋅超氧化物歧化酶活性較無機鋅（ZnSO4、ZnO）處理組顯著升高（P＜0.05），但在各氨基酸螯合鋅和無機鋅處理組間無顯著差異（P＞0.05）。不同鋅源對肝臟中堿性磷酸酶、谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶和乳酸脫氫酶影響無顯著差異（P＞0.05）。

2.4 不同鋅源對十二指腸黏膜MT mRNA相對表達量的影響

不同鋅源對肉雞十二指腸黏膜MT mRNA相對表達量影響見表6。

表4 不同鋅源對肉雞肝臟和胰臟金屬硫蛋白含量的影響Table4 Effects of different Zn source on broiler'liver,pancrease MT and concentration

表5 不同鋅源對肝臟酶活性的影響Table5 Effects of different Zn sources on enzymes activity of liver in broilers

表6 不同鋅源對肉雞十二指腸黏膜MT mRNA相對表達量的影響Table6 Effects of different Zn source on broiler'MT mRNA expression of duodenal mucosa

氨基酸螯合鋅（ZnMet、ZnLys）處理組對肉雞十二指腸腸黏膜MT mRNA相對表達量較無機鋅（ZnSO4、ZnO）處理組顯著升高（P＜0.05）。但在各氨基酸螯合鋅（ZnMet、ZnLys）處理組和無機鋅（Zn?SO4、ZnO）處理組之間的MT mRNA相對表達量無顯著差異（P＞0.05）。

3 討論與結論

3.1 不同鋅源對肝臟和胰臟金屬硫蛋白含量及十二指腸黏膜MT mRNA相對表達量的影響

金屬硫蛋白是一類小分子質量富含半胱氨酸（33%）的金屬結合蛋白。MT特點是可以高親和力與鋅和其他重金屬結合，每分子MT可結合7原子鋅[11-12]。在雞組織中僅存在1種MT，這種形式的MT已被證明存在于雞的肝、胰、腎和小腸黏膜中[13]。當外界環(huán)境鋅濃度較高時，MT表達增加，可結合并儲存鋅，缺鋅時，MT表達減少。日糧鋅的攝入直接反映組織中金屬硫蛋白合成[14]。在體液和組織中MT是反映不同鋅源吸收率敏感指標[15]。Rojas等研究發(fā)現(xiàn)，賴氨酸鋅處理組顯著提高羊的肝臟、腎臟、胰臟金屬硫蛋白含量[16]。Reeves等報道，給大鼠飼喂高鋅飼糧，肝臟MT顯著增加[17]。Fleet等通過注射或口飼補鋅24 h內，雛雞肝和胰MT明顯增加[18]。

本試驗亦發(fā)現(xiàn)，氨基酸螯合鋅處理對肝臟和胰臟中金屬硫蛋白濃度雖未顯著高于無機鋅組，但有升高趨勢。Levenson等研究發(fā)現(xiàn)，給大鼠飼喂含鋅1、30及180 mg·kg-1飼糧16 d后，其回腸MT mRNA水平隨飼糧鋅水平增加而顯著增加[19]。于昱研究結果表明，不同絡合強度有機鋅與無機鋅相比，可以增加十二指腸黏膜MT基因相對表達量[20]。本試驗研究結果與上述報道一致，氨基酸螯合鋅（ZnMet、ZnLys）處理組肉雞十二指腸黏膜MT mRNA相對表達量顯著高于無機鋅（ZnSO4、ZnO）處理組，符合氨基酸螯合鋅的競爭吸收假說，即氨基酸螯合鋅可避免腸腔中沉淀劑對礦物元素的沉淀或吸附作用，直接到達小腸刷狀緣，在吸收位點處發(fā)生水解，鋅以離子形式進入腸上皮細胞。

3.2 不同鋅源對血液和其他組織鋅含量的影響

機體血液和組織鋅濃度作為反映鋅在機體吸收利用率的敏感指標已經(jīng)被證實[21]。根據(jù)不同鋅源和不同鋅水平代謝利用上的差異，各組織器官對進食鋅的反應敏感性也不同。李杰研究報道，在10～50 mg·kg-1鋅條件下，肝臟、脛骨鋅對飼糧鋅水平的變化均較敏感，均是評價飼糧鋅的良好指標[22]。Ao等報道，飼喂氨基酸螯合鋅飼糧組較硫酸鋅組能顯著提高肉雞肝臟鋅含量[23]。Wedekind等研究發(fā)現(xiàn)，在肉雞中飼喂蛋氨酸鋅組中脛骨鋅含量顯著高于氧化鋅和硫酸鋅組[24]。Schell等研究表明，給豬飼喂含2 000 mg Zn/kg的蛋氨酸鋅的飼糧組肝臟和血液鋅含量顯著高于氧化鋅組[25]。Hahn等報道，飼喂3 000 mg Zn/kg，蛋氨酸組血液中鋅含量顯著高于硫酸鋅組[26]。Salim等研究表明，在肉雞日糧中額外添加25 mg Zn/kg的有機鋅和無機鋅，有機鋅組血液中鋅含量顯著增加[27]。本試驗證實，氨基酸螯合鋅（ZnMet、ZnLys）處理組血液、肝臟和脛骨鋅含量顯著高于無機鋅（ZnSO4、ZnO）處理組，與前人研究結果一致。

3.3 不同鋅源對肝臟酶活性的影響

鋅參與機體300多種酶和功能蛋白的組成，在動物體內主要通過酶或功能蛋白而參與一系列重要生化反應。在本試驗中，不同鋅源對肝臟中堿性磷酸酶、谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶和乳酸脫氫酶并無顯著影響，說明飼喂的鋅含量足以滿足這4種酶的活性，并且這4種酶不是反映鋅吸收的敏感指標，與Yuan等研究結果[28]一致。鋅是銅鋅超氧化物歧化酶結構和功能的重要組成部分以及酶的激活劑，分布極為廣泛，約占到總超氧化物歧化酶的90%[29]。因此，銅鋅超氧化物歧化酶可以作為在體內評價鋅吸收的生物參數(shù)[30]。Coudray等在人和大鼠上采用體內和體外實驗相結合證明鋅可以調節(jié)Cu/Zn-SOD活力，認為Cu/Zn-SOD活力可以反映機體的鋅營養(yǎng)狀況[31]。曹國華等在小鼠上的研究結果則表明缺鋅會導致肝臟Cu/Zn-SOD活力降低，補鋅(50 mg·kg-1)以后可以得到恢復[32]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸螯合鋅處理組肝臟中銅鋅超氧化物歧化酶活性顯著高于無機鋅組，與前人研究結果一致。

本試驗結果表明，氨基酸螯合鋅能顯著提高肉雞血液、肝臟和脛骨鋅含量，提高銅鋅超氧化物歧化酶活性，調控十二指腸黏膜金屬硫蛋白基因表達。

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