利用連接介導(dǎo)PCR檢測外源基因整合位點(diǎn)體系的建立

劉 娣，李 斌，張冬杰

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，哈爾濱 150086；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

外源基因整合位點(diǎn)檢測，是鑒定轉(zhuǎn)基因動物的最基本、最重要步驟。整合位點(diǎn)側(cè)翼序列是外源基因表型研究和功能探討的前提條件，對目的基因正常轉(zhuǎn)錄和表達(dá)有重要影響[1]。外源基因整合到宿主基因組發(fā)生在DNA復(fù)制S期，以多位點(diǎn)和單一位點(diǎn)形式隨機(jī)插入受體基因組中的任意位置，存在毒性整合、有效整合和沉默整合三種整合狀態(tài)，其表達(dá)水平不同[2]。目前檢測外源基因整合位點(diǎn)方法主要通過分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)方法進(jìn)行檢測，主要有PCR法，DNA斑點(diǎn)雜交，Southern印跡法等，其中以PCR方法最為簡單、快捷。人們以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)設(shè)計了很多種擴(kuò)增未知序列的染色體步移方法，如反向PCR法（inverse PCR，I-PCR），熱不對稱交錯PCR法（thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR）和連接介導(dǎo)PCR法（ligation mediated PCR，LM-PCR）[3-4]。

LM-PCR法的基本原理是首先將基因組DNA用特異性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，而后連接單鏈、雙鏈或部分雙鏈的接頭，用序列特異引物和接頭引物引發(fā)PCR擴(kuò)增。通過對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆測序，即可獲得外源基因的整合位點(diǎn)信息。但在PCR反應(yīng)過程中，易發(fā)生單鏈或部分單鏈接頭的凹入末端被補(bǔ)平，或接頭的單鏈部分被降解等現(xiàn)象，這些副反應(yīng)都將導(dǎo)致非特異擴(kuò)增的增加，而難以得到特異性產(chǎn)物。為降低副反應(yīng)的發(fā)生從而提高產(chǎn)物的特異性，TaKaRa和Clontech公司都通過對接頭進(jìn)行氨基修飾以抑制接頭引物的擴(kuò)增，接頭的5'末端沒有磷酸基，所以不能與酶切基因組的3'末端連接，形成缺口，這樣就可以高效且特異性地擴(kuò)增外源基因側(cè)翼序列。目前，LM-PCR技術(shù)在外源基因定位方面應(yīng)用較多，但是由于其擴(kuò)增長度往往比較短（＜1kb），若想獲得更長的片段只能通過幾次步移后才能得到[5-7]。

黑素皮質(zhì)素受體4（MC4R）基因是影響豬生長肥育性能的主效基因之一，是參與調(diào)控體重、采食和能量平衡的關(guān)鍵信號物質(zhì)[8-9]。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中獲得轉(zhuǎn)豬MC4R基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。為檢測轉(zhuǎn)入豬MC4R基因在小鼠基因組上整合位點(diǎn)，本研究采用LM-PCR法對外源基因的整合位點(diǎn)進(jìn)行檢測，以期建立轉(zhuǎn)基因動物檢測體系，為轉(zhuǎn)基因動物研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 轉(zhuǎn)豬MC4R基因小鼠DNA

黑龍江省農(nóng)科院畜牧研究所分子實(shí)驗(yàn)室凍存。

1.1.2 工具酶，試劑盒及其他試劑

限制性內(nèi)切酶、dNTP、DNA連接酶、DNA Marker、rTaq酶均購自Takara公司；西班牙瓊脂糖、胰蛋白胨、二水乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA-Na2·2H2O）、酵母提取物、三羥甲基氨基甲烷（Tris）均購自哈爾濱英俊生物技術(shù)有限公司；PCR純化試劑盒購自北京天根生化公司。

1.2 方法

1.2.1 帶有接頭引物及特異性引物序列設(shè)計

參考Clontech公司試劑盒內(nèi)接頭序列合成本試驗(yàn)所用的接頭，接頭序列為：

5'GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTG?GTCGACGGCCCGGGCTGGT 3'和5'PO4-ACCAG CCC-NH23'；根據(jù)接頭序列設(shè)計接頭引物AP1和AP2，AP1:5'GTAATACGACTCACTATAG GGC 3'，AP2：5'ACTATAGGGCACGCGTGGT 3'；根據(jù)插入的基因片段啟動子區(qū)序列（pcDNA3.1（+）PCMV區(qū)）設(shè)計特異性引物SP1和SP2，SP1:5'TAATA GGGTGGTGACAATGGTTTCTG 3'；SP2:5'GT CG?GTCAAGCCTTGCCTTGTTGTAG 3'，送交Invitrogen公司合成。

1.2.2 基因組的酶切與純化

隨機(jī)選取1只轉(zhuǎn)基因陽性鼠的基因組為試驗(yàn)材料，分別用4種限制性內(nèi)切酶（DraⅠ，EcoRV，PvuⅡ，SspⅠ）37℃過夜酶切。反應(yīng)體系為：25 μL基因組 DNA（0.1 μg· μL-1），8 μL 限制性酶（10 units· μL-1），10 μL限制性酶緩沖液（10X），57 μL去離子水。酶切結(jié)束后，取5 μL酶切產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳檢測并觀察結(jié)果。

采用苯酚-氯仿方法純化酶切后的基因組DNA。①對每個反應(yīng)管中加入等體積量（95 μL）的苯酚，低速離心，轉(zhuǎn)移上層（水相）到一個新的1.5 mL EP管中。②在每個EP管中，加入等體積量（95 μL）的氯仿，低速離心，移上清到1個新的1.5 mL EP管中。③每個EP管加入2倍體積（190 μL）冰的 95%乙醇，1/10體積（9.5 μL）3 mol·L-1NaOAc（pH 4.5）和20 μg糖原，在4 ℃ 14 000 r·min-1下離心15 min。④倒出上清，用100 μL 80%的冰乙醇清洗滌沉淀，在4℃14 000 r·min-1下離心10 min，室溫下干燥沉淀，加入20 μL TE（Tris：EDTA=10：0.1，pH 7.5）溶解沉淀，并從每個管中取出1 μL溶液在0.5%瓊脂糖中電泳檢測。

1.2.3 純化后的基因組DNA連接接頭

連接體系為：4 μL純化后的基因組DNA,1.9 μL接頭（25 μmol· L-1，1.6 μL 10X ligation buffer，0.5 μL T4DNA連接酶（6 units·μL-1）。16℃過夜連接。

1.2.4 兩輪PCR擴(kuò)增檢測

將上一步連接產(chǎn)物加入72 μL TE（Tris:EDTA=10∶1，pH 7.5）稀釋并在70℃下5 min終止反應(yīng)。以此為PCR模板，以AP1和SP1為引物進(jìn)行第1輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：40 μL去離子水，5 μL Buf?fer，1 μL dNTP，1 μL AP1，1 μL SP1，1 μL酶切產(chǎn)物，1 μL LA Taq酶，下同。反應(yīng)條件為：7 cycles:94℃ 25 s，72℃ 3 min；32 cycles:94℃25 s，67℃3 min；67℃7 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳并分析結(jié)果。對擴(kuò)增出條帶的產(chǎn)物，用去離子水50倍稀釋作為第2次PCR擴(kuò)增模板，以AP2和SP2為引物做第2輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：5 cycles:94℃25 s，72℃ 3 min；20 cycles:94℃25 s，67℃ 3 min；67℃7 min。取5 μL酶切產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳并分析結(jié)果。

1.2.5 克隆測序與序列比對

將第2輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的目的條帶回收純化，連入pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌后，搖菌，送交Invitrogen公司測序。將測得的結(jié)果采用BLAST方法與NCBI網(wǎng)站上已提交的小鼠基因組序列進(jìn)行比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組的酶切與純化

轉(zhuǎn)基因陽性小鼠的基因組DNA經(jīng)EcoRV，PvuⅡ，DraⅠ，SspⅠ過夜酶切后，均呈現(xiàn)出彌散狀態(tài)（見圖1），說明基因組DNA已經(jīng)被切開，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 基因組酶切Fig.1 Enzyme digestion of genome

2.2 兩輪PCR擴(kuò)增檢測結(jié)果

基因組分別經(jīng)酶切后，第1輪PCR反應(yīng)后，EcoRV和PvuⅡ酶切后的基因組沒有擴(kuò)增出特異條帶，DraⅠ和SspⅠ酶切后的基因組擴(kuò)增出特異條帶（見圖2）。以EcoRV，PvuⅡ，DraⅠ和SspⅠ分別對應(yīng)的第1輪PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增，仍舊是DraⅠ和SspⅠ所對應(yīng)的產(chǎn)物獲得了單一的特異條帶，大小在250～1 000 bp（見圖3）。

圖2 第1輪PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 First PCR amplification results

圖3 第二輪PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Second PCR amplification results

2.3 克隆測序與序列比對

對上述試驗(yàn)所獲得的2條特異條帶克隆測序，經(jīng)過序列比對發(fā)現(xiàn)，2條特異條帶實(shí)為同一個序列片段（見圖4），只是片段大小不同。以其中的長片段為目的片段，通過序列比對發(fā)現(xiàn)，其中133 bp為已知的載體序列，430 bp為未知序列（見圖5）。以該序列為源序列，與NCBI網(wǎng)站已提交的小鼠基因組序列比對后發(fā)現(xiàn)，所克隆到的未知序列與小鼠6號染色體37 236 325～37 236 754之間的序列100%同源（見圖6）。

圖4 兩條特異條帶克隆序列比對結(jié)果Fig.4 Result of Two specific bands cloned sequence blast

圖5 序列信息Fig.5 Sequence information

圖6 Blast比對結(jié)果Fig.6 Blast result

3 討論與結(jié)論

外源基因的整合受多因素影響，如DNA構(gòu)型，DNA的濃度和進(jìn)入宿主細(xì)胞的方式等。一般認(rèn)為，外源基因整合位點(diǎn)對其表達(dá)水平有重要影響，同樣一個外源基因可在一定的整合位點(diǎn)正常表達(dá)，而在另一些位點(diǎn)不表達(dá)或低水平表達(dá)。所以，外源基因整合位點(diǎn)的檢測對研究外源基因的表型和功能十分重要[10]。

目前擴(kuò)增外源基因整合位點(diǎn)方法很多，如LM-PCR，TALL-PCR等。本試驗(yàn)通過LM-PCR測得外源基因整合位點(diǎn)，對接頭的3'端采用氨 基酸修飾克服單引物擴(kuò)增，并提高擴(kuò)增效率[11]。本試驗(yàn)只得到一個整合位點(diǎn)（Blast比對后發(fā)現(xiàn)2條特異條帶為同一整合位點(diǎn)），可看出LM-PCR方法 雖然結(jié)果準(zhǔn)確但效率較低，操作比較復(fù)雜（需要一系列處理，如酶切，連接純化），擴(kuò)增片段較短（＜2 000 bp）?？赡軙懈嗾衔稽c(diǎn)，但本試驗(yàn)僅檢測出一個，其余整合位點(diǎn)還需通過更換內(nèi)切酶的方法進(jìn)一步檢測。在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，第一輪PCR擴(kuò)增很難擴(kuò)增出特異條帶，甚至無特異條帶，但是如果將稀釋倍數(shù)放小，在第二輪PCR擴(kuò)增時也會擴(kuò)增出特異條帶，可能是限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)距離目的基因過遠(yuǎn)或接頭序列與酶切產(chǎn)物的連接效率較低，導(dǎo)致PCR很難擴(kuò)增出目的片段。如果能克服酶切的不確定性，將使LM-PCR的染色體步移方法成功率提高。由此可見，使用LM-PCR進(jìn)行外源基因整合位點(diǎn)檢測雖然有效，但反應(yīng)參數(shù)仍需完善。

本研究采用LM-PCR方法檢測到整合到小鼠基因組上的豬MC4R基因，該整合位點(diǎn)位于小鼠第6號染色體的37 236 754 bp處。初步建立了采用LM-PCR對外源基因整合位點(diǎn)檢測的體系，可為今后轉(zhuǎn)基因動物的檢測奠定基礎(chǔ)。

[1]吳波,朱作言.轉(zhuǎn)基因動物整合位點(diǎn)的研究進(jìn)展[J].遺傳,2003,25(1):77-80.

[2]譚貝貝,蘇紅,胡嘉祺.轉(zhuǎn)基因克隆牛外源基因整合位點(diǎn)的研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2012,28(17):28-32.

[3]孔慶然,武美玲,朱江,等.轉(zhuǎn)基因豬中外源基因拷貝數(shù)和整合位點(diǎn)的研究[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2009,36(12):1617-1625.

[4]Liu Y G,Whittier R F.Thermal asym metric interlaced PCR:auto?matable amplification and sequencing of insert end fragmentsfrom P1 and YAC clones for chromosome walking[M].Genomics,1995,25(801):674-681.

[5]王閔霞,馬欣榮,王天山,等.染色體步行PCR技術(shù)[J].應(yīng)用與環(huán)境生物報,2006,12(3):427-430.

[6]Redstone JS,WoodwardMJ.The developmentofa ligasemediated PCR with potential for the of serovars with Leptospira interrogans[J].Veter Microbiol,1996,51(3):351-362.

[7]Tormanen VT,Seiderski PM,Kaplan BE,et al.Extension product capture improves genomic sequencing and DNase? footprinting by ligation mediated PCR[J].Nucleic Acids Research,1992,20:5487.

[8]霍明東,王守志,李輝.MC4R基因多態(tài)性與雞生長和體組成性狀的相關(guān)研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2006,37(2):184-189.

[9]宋軍,王振坤,孔慶然,等.利用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)表達(dá)綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因豬胚胎的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2008,39(3):64-69.

[10]王繼英,杜立新.轉(zhuǎn)基因動物制作及提高外源基因表達(dá)的策略[J].中國畜牧獸醫(yī),2002,2(92):30-34.

[11]劉春香,張衛(wèi)華,孫小鐳.基于PCR的染色體步移中單引物擴(kuò)增的克服與非特異引物的利用[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報,2010,26(4):380-385.