原花青素對(duì)阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶功能及海馬nNOS表達(dá)的影響

王 歡，姚 海，鄭書國(guó)，馬玉紅，張俊秀，楊解人

(皖南醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是威脅老年人身體健康的常見疾病，表現(xiàn)為慢性退行性神經(jīng)系統(tǒng)病變，其基本的病理學(xué)特征為神經(jīng)細(xì)胞外以β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)沉積為核心的老年斑(senile plaques，SP)和神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)以Tau蛋白過(guò)度磷酸化所致的神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrilary tangles，NFTs)［1］，目前尚無(wú)有效的治療藥物［2］。

原花青素(procyanidins，PC)是植物中廣泛存在的一種多酚化合物，是植物體內(nèi)天然的抗氧化物質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗突變、抗病毒、抗真菌等多種生物學(xué)活性［3－4］。目前有關(guān)PC的研究主要集中于心血管、糖尿病及癌癥等方面，極少涉及神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。鑒于PC具有強(qiáng)大的抗氧化能力，而AD發(fā)病機(jī)制中氧化應(yīng)激是促進(jìn)Aβ聚集，進(jìn)而造成AD發(fā)病和進(jìn)展的原因之一，故而推測(cè)PC對(duì)AD可能具有治療作用。本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射D-半乳糖聯(lián)合AlCl3灌胃制備大鼠AD模型，觀察原花青素對(duì)AD的學(xué)習(xí)記憶功能及海馬nNOS表達(dá)的影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)10周齡SD大鼠80只，體質(zhì)量為(150±20)g，許可證號(hào):SCXK(蘇)2009-0002，購(gòu)于蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;正常顆粒飼料均購(gòu)自于南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物試驗(yàn)中心。

1．2 主要試劑及儀器 原花青素為葡萄籽提取物(純度＞95%，天津尖峰天然產(chǎn)物公司);維生素E(北大國(guó)際醫(yī)院集團(tuán)西南合成制藥股份有限公司，批號(hào)H50020272);三氯化鋁(AlCl3)(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20110506);D-半乳糖(D-gal)(reanta scientific technology company);SABC試劑盒(武漢博士德公司，編號(hào)SA-1052);nNOS抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，編號(hào)bs-0156R);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔lgG(A0208)、尼氏(Nissl)染色液(C0117)、一氧化氮檢測(cè)試劑盒(S0021)購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)研究所。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)［5］(中國(guó)科學(xué)院心理健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室隋南實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng));Olympus顯微鏡及成像系統(tǒng)(日本);黑馬病理圖像分析儀(珠海黑馬儀器生產(chǎn)公司);DNM-9602酶標(biāo)分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)。

1．3 造模與分組 正常SD大鼠80只，設(shè)立空白對(duì)照組(NSip，NS ig)15只，其余大鼠腹腔注射D-半乳糖［D-gal，180 mg/(kg·d)］聯(lián)合灌胃三氯化鋁［AlCl3，15 mg/(kg·d)］連續(xù) 12 周后，Morris水迷宮法檢測(cè)篩選造模成功大鼠，于第13周開始隨機(jī)分為4組，每組15只，分別為AD模型組(NS ip，D-gal ip+AlCl3ig)，原花青素高劑量組(PC 40 mg/kg;D-gal ip+AlCl3ig)，原花青素低劑量組(PC 10 mg/kg;D-gal ip+AlCl3ig)，維生素E陽(yáng)性對(duì)照組(VitE 10 mg/kg;D-gal ip+AlCl3ig)，繼續(xù)給藥8周后結(jié)束實(shí)驗(yàn)并分別檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。

1．4 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè) 全部給藥結(jié)束后采用Morris水迷宮系統(tǒng)測(cè)試大鼠學(xué)習(xí)記憶能力［5］。定位航行實(shí)驗(yàn)，連續(xù)5 d，每日1次，包括分別從4個(gè)象限(隨機(jī))面向池壁入水，每個(gè)間隔30 s。軟件的最長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)間設(shè)為60 s，駐臺(tái)時(shí)間5 s(作為找到平臺(tái)的標(biāo)準(zhǔn))。若大鼠能找到并登上平臺(tái)，在平臺(tái)上停留5 s后停止記錄，將軟件記錄的大鼠在水中游泳的時(shí)間記為逃避潛伏期;若大鼠60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則在軟件停止計(jì)時(shí)后由實(shí)驗(yàn)者引導(dǎo)其登上平臺(tái)并停留15 s，此時(shí)的逃避潛伏期計(jì)為60 s。由此將4個(gè)象限入水的4個(gè)檢測(cè)求出平均結(jié)果，記為當(dāng)天的檢測(cè)結(jié)果，最后取5 d的平均值來(lái)進(jìn)行大鼠逃避潛伏期的統(tǒng)計(jì)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)，在第5天定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后1 h，把平臺(tái)撤離，將大鼠從原平臺(tái)所在象限的對(duì)側(cè)象限入水，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)1次，記錄大鼠在60 s內(nèi)穿越原平臺(tái)所在位置的次數(shù)。數(shù)據(jù)采集和處理由Morris水迷宮視頻追蹤系統(tǒng)完成。

1．5 標(biāo)本采集 行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，將大鼠稱重、麻醉(1%戊巴比妥鈉 0．3 ml/100 g，i．p)后迅速斷頭處死大鼠，每組各取7只大鼠的整腦，4%的多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，石蠟切片用于病理學(xué)觀察。每組剩下的8只大鼠取海馬，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．6 尼氏(Nissl)染色 常規(guī)石蠟切片(5μm)，放入60℃烘箱2 h烤干后，常規(guī)脫蠟至水。加入尼氏染色液5 min后，用蒸餾水沖洗兩次后常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片，光鏡下觀察大鼠海馬神經(jīng)元尼氏小體的變化。

1．7 海馬NO含量檢測(cè) 從－80℃冰箱取出大鼠海馬，加入PBS緩沖液制成10%勻漿，4℃12 000 r/min離心10 min，取上清液按試劑盒說(shuō)明采用Griess Reagent法檢測(cè)NO含量。

1．8 免疫組化染色 常規(guī)石蠟切片(5μm)脫蠟至水，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶后浸入0．01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液，微波熱抗原修復(fù)，冷卻后封閉。滴加一抗nNOS抗體(1∶200)，4℃冰箱過(guò)夜后分別依次滴加二抗、SABC，PBS洗3次，DAB顯色。顯色之后常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片，光鏡下觀察。每組選取相同冠狀切面的切片7張，海馬定位后觀察每張切片海馬各個(gè)區(qū)的神經(jīng)元陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，并用黑馬病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)量細(xì)胞平均灰度值。

1．9 數(shù)據(jù)處理 采用DAS 2．0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示。多組均數(shù)間兩兩比較，方差齊時(shí)用t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)則用t'檢驗(yàn)。以P＜0．05為有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2．1 原花青素對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P＜0．01)，而穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P＜0．01);與模型組相比，原花青素組和維生素E陽(yáng)性組大鼠的逃避潛伏期均明顯縮短(P＜0．01或P＜0．05)，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加(P＜0．05)。說(shuō)明原花青素組能有效改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力(表1)。

2．2 尼氏(Nissl)染色 尼氏染色顯示背景色為藍(lán)色，正常對(duì)照組海馬神經(jīng)元細(xì)胞染色清晰，排列緊密、規(guī)則，形態(tài)完整。與正常對(duì)照組相比，AD大鼠模型組海馬神經(jīng)元細(xì)胞排列疏松不均，明顯減少，細(xì)胞出現(xiàn)空染或淡染，形態(tài)不規(guī)則。與模型組相比，原花青素組和維生素E陽(yáng)性組的海馬神經(jīng)元排列較緊密規(guī)則，空染或淡染細(xì)胞較少。說(shuō)明原花青素對(duì)AD大鼠模型有一定的改善作用(圖1～4)。

圖1 大鼠海馬CA1區(qū)尼氏染色(×400)1．正常對(duì)照組;2．模型組;3．維生素E陽(yáng)性組;4．原花青素高劑量組;5．原花青素低劑量組Fig 1 Nissl staining for the hippocampal CA1 region(×400)1．Control group;2．Model group;3．Vitamin E group;4．High dosage of procyanidins;5．Low dosage of procyanidins

圖2 大鼠海馬CA2區(qū)尼氏染色(×400)1．正常對(duì)照組;2．模型組;3．維生素E陽(yáng)性組;4．原花青素高劑量組;5．原花青素低劑量組Fig 2 Nissl staining for the hippocampal CA2 region(×400)1．Control group;2．Model group;3．Vitamin E group;4．High dosage of procyanidins;5．Low dosage of procyanidins

圖3 大鼠海馬CA3區(qū)尼氏染色(×400)1．正常對(duì)照組;2．模型組;3．維生素E陽(yáng)性組;4．原花青素高劑量組;5．原花青素低劑量組Fig 3 Nissl staining for the hippocampal CA3 region(×400)1．Control group;2．Model group;3．Vitamin E group;4．High dosage of procyanidins;5．Low dosage of procyanidins

圖4 大鼠海馬DG區(qū)尼氏染色(×400)1．正常對(duì)照組;2．模型組;3．維生素E陽(yáng)性組;4．原花青素高劑量組;5．原花青素低劑量組Fig 4 Nissl staining for the hippocampal DG region(×400)1．Control group;2．Model group;3．Vitamin E group;4．High dosage of procyanidins;5．Low dosage of procyanidins

2．3 大鼠海馬組織NO含量 與正常對(duì)照組相比，模型組NO含量明顯升高(P＜0．01);與模型組相比，原花青素高劑量組和維生素E陽(yáng)性對(duì)照組NO含量明顯降低(P＜0．01)，而原花青素低劑量組NO含量有所降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(表2)。

2．4 免疫組化染色 海馬各個(gè)區(qū)內(nèi)nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元胞漿染色多呈棕色，少數(shù)深染呈棕褐色，胞體輪廓清晰。與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠各個(gè)區(qū)nNOS陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)均明顯增多，灰度值明顯降低(P＜0．01)，且以CA3區(qū)最為明顯。與模型組相比，CA1、CA2、CA3、DG四個(gè)區(qū)的維生素E陽(yáng)性組和原花青素高劑量組nNOS陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)明顯減少，灰度值明顯升高(P＜0．01)，而原花青素低劑量組則在CA1區(qū)和DG區(qū)改變不是很明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(表3，圖5～8)。

圖5 大鼠海馬CA1區(qū)nNOS的表達(dá)(×400)1．正常對(duì)照組;2．模型組;3．維生素E陽(yáng)性組;4．原花青素高劑量組;5．原花青素低劑量組Fig 5 Expression of nNOSat the hippocampal CA1 region(×400)1．Control group;2．Model group;3．Vitamin E group;4．High dosage procyanidins;5．Low dosage of procyanidins

圖6 大鼠海馬CA2區(qū)nNOS的表達(dá)(×400)1．正常對(duì)照組;2．模型組;3．維生素E陽(yáng)性組;4．原花青素高劑量組;5．原花青素低劑量組Fig 6 Expression of nNOSat the hippocampal CA2 region(×400)1．Control group;2．Model group;3．Vitamin E group;4．High dosage procyanidins;5．Low dosage of procyanidins

圖7 大鼠海馬CA3區(qū)nNOS的表達(dá)(×400)1．正常對(duì)照組;2．模型組;3．維生素E陽(yáng)性組;4．原花青素高劑量組;5．原花青素低劑量組Fig 7 Expression of nNOSat the hippocampal CA3 region(×400)1．Control group;2．Model group;3．Vitamin E group;4．High dosage procyanidins;5．Low dosage of procyanidins

圖8 大鼠海馬DG區(qū)nNOS的表達(dá)(×400)1．正常對(duì)照組;2．模型組;3．維生素E陽(yáng)性組;4．原花青素高劑量組;5．原花青素低劑量組Fig 8 Expression of nNOSat the hippocampal DG region(×400)1．Control group;2．Model group;3．Vitamin E group;4．High dosage procyanidins;5．Low dosage of procyanidins

表1 不同劑量原花青素對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響(ˉx±s，n=15)Tab 1 Effects of different dosage of procyanidins on the learning and memory ability in AD model rats(ˉx±s，n=15)

表2 海馬組織NO含量變化(ˉx±s，n=8)Tab 2 The changes in the content of NO at hippocampus(ˉx±s，n=8)

表3 不同劑量原花青素對(duì)AD大鼠海馬各個(gè)區(qū)nNOS表達(dá)的影響(ˉx±s，n=7)Tab 3 Effects of different dosage of procyanidins on nNOSexpression in AD model rats(ˉx±s，n=7)

3 討論

研究表明［6］，動(dòng)物長(zhǎng)期注射D-半乳糖可以使其多器官功能衰退而出現(xiàn)亞急性衰老表現(xiàn);鋁是一種神經(jīng)毒素，與 AD 的發(fā)生也密切相關(guān)［7－9］;Abdel-Aal等［10］也證實(shí)了給動(dòng)物服用或注射氯化鋁，動(dòng)物均出現(xiàn)明顯的認(rèn)知行為障礙。研究也已經(jīng)證實(shí)，采用腹腔注射D-半乳糖和灌胃AlCl3合并制備大鼠AD模型，模型鼠出現(xiàn)了膽堿能神經(jīng)元及其他神經(jīng)元不同程度的丟失，學(xué)習(xí)記憶能力減退，腦組織出現(xiàn)Aβ沉積并有類SP和NFT形成，可較成功地模擬AD的發(fā)病及病理特征［11］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Morris水迷宮法檢測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和尼氏染色觀察海馬神經(jīng)元尼氏小體的變化也進(jìn)一步證實(shí)了這一模型的成功。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，海馬是學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)鍵腦區(qū)。海馬的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potential，LTP)是公認(rèn)的腦學(xué)習(xí)記憶功能在突觸水平的研究模型和細(xì)胞基礎(chǔ)。NO是參與LTP形成的逆行信使［12－13］，主要通過(guò)谷氨酸-一氧化氮-環(huán)磷酸鳥苷(Glu-NO-cGMP)通路參與 LTP 的形成。研究表明［14－15］，低濃度的NO可通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，而過(guò)量的NO則導(dǎo)致神經(jīng)毒性從而引起認(rèn)知功能障礙［16－17］。nNOS主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的大腦皮質(zhì)、海馬、小腦、下丘腦、腦干等部位的神經(jīng)元內(nèi)，神經(jīng)元通過(guò)激活nNOS產(chǎn)生NO［18］。研究認(rèn)為，nNOS的過(guò)度表達(dá)可作為一個(gè)重要介導(dǎo)因素引起NO的神經(jīng)毒性作用，從而導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡和變性壞死［19］，而抑制nNOS的產(chǎn)生對(duì)神經(jīng)元的損傷具有保護(hù)作用［20］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了AD大鼠模型海馬內(nèi)的nNOS表達(dá)是明顯增加的，尤其以CA3區(qū)最為明顯，提示海馬CA3區(qū)可能是AD模型大鼠受損最嚴(yán)重的區(qū)域。

荷蘭的一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，高劑量維生素C及維生素E能延緩AD的發(fā)展;銀杏提取物EGB761及五味子酚等均是抗氧化劑，能清除自由基、增強(qiáng)中樞膽堿能功能、增加腦血流量以及改善腦正常功能代謝而延緩衰老，防治AD［21－22］。由于PC具有強(qiáng)大的抗氧化能力，故而推測(cè)PC對(duì)AD可能具有治療作用。蔡洪斌等［23］證實(shí)了原花青素可以改善AD模型大鼠的認(rèn)知功能，通過(guò)清除自由基和抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用來(lái)提高AD模型大鼠腦組織的抗氧化能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說(shuō)明了原花青素對(duì)nNOS的活性和表達(dá)有一定抑制作用，這一作用使NO含量減少，亦減少了NO的神經(jīng)毒性。

本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射D-半乳糖和灌胃AlCl3合并成功制備大鼠AD模型。原花青素可能通過(guò)下調(diào)AD模型大鼠海馬nNOS表達(dá)，從而減少因NO的產(chǎn)生所引起的神經(jīng)損傷，這可能是原花青素治療AD的機(jī)制之一。

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