眼鏡蛇毒對大鼠弓狀核c-fos和c-jun表達(dá)的影響

劉 敏，黃 銳，熊克仁

(皖南醫(yī)學(xué)院 解剖學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

眼鏡蛇毒是由眼鏡蛇的毒腺分泌的具有多種酶效應(yīng)的毒性蛋白質(zhì)，以神經(jīng)毒素為主。一旦咬傷，即可引起一系列的自主神經(jīng)功能紊亂的癥狀和體征［1］。下丘腦弓狀核(arcuate nucleus，ARC)為控制自主神經(jīng)活動的中樞核團(tuán)之一，參與對各種自主神經(jīng)功能活動的調(diào)節(jié)。c-fos和c-jun基因均是即刻早期基因(immediate early response genes，IEGs)，在受到傷害性刺激時(shí)，產(chǎn)物Fos蛋白和Jun蛋白以Fos-Jun的形式快速表達(dá)，因此可作為神經(jīng)元受到刺激后其活動增強(qiáng)的標(biāo)志物［2－3］。本實(shí)驗(yàn)從形態(tài)學(xué)角度觀察眼鏡蛇毒對大鼠弓狀核c-fos和c-jun表達(dá)的影響，探討眼鏡蛇毒中毒的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動物 SD大鼠27只，雌雄不拘，體質(zhì)量(250±20)g，由皖南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1．2 主要試劑 眼鏡蛇毒購自安徽黃山屯溪縣毒蛇養(yǎng)殖研究所。兔抗大鼠c-fos抗體和c-jun抗體、SABC免疫組化試劑盒和DAB顯色液均購自武漢博奧森生物工程有限公司。

1．3 實(shí)驗(yàn)分組及方法 將SD大鼠隨機(jī)分成3組，眼鏡蛇毒組、生理鹽水組和正常對照組，每組9只。眼鏡蛇毒組:大鼠右側(cè)大腿常規(guī)消毒后，將生理鹽水與干粉狀眼鏡蛇毒按3∶1稀釋，按0．5μl/㎏量于右側(cè)大腿下部肌肉注射;生理鹽水組:在相同部位注入等量生理鹽水;正常對照組不作任何處理。均觀察60 min，發(fā)現(xiàn)眼鏡蛇毒組大鼠右側(cè)腿部紅腫，煩躁不安，嘴唇和四肢紫紺，呼吸困難等明顯中毒癥狀時(shí)處死，同時(shí)處死生理鹽水組和正常對照組大鼠。取下丘腦節(jié)段，石蠟包埋，切片，片厚5μm，切片常規(guī)脫蠟，再按下列步驟依次進(jìn)行:滴加0．3%H2O2室溫(18℃ ～25℃)12 min，PBS洗5 min×3次;微波修復(fù)，待自然冷卻后PBS洗5 min×3次;封閉液孵育(37℃)1 h;滴加一抗 c-fos(1∶150)、c-jun(1∶1 200)，4℃冰箱過夜;37℃復(fù)溫，PBS洗5 min×3次，滴加生物素化羊抗兔IgG(37℃)2 h，PBS洗5 min×3次;滴加 SABC(37℃)1 h，PBS洗5 min×3次;DAB顯色30 min，流水沖洗阻斷反應(yīng)，二甲苯透明、中性樹膠封片，光鏡觀察，使用黑馬圖片分析軟件系統(tǒng)拍攝及分析圖片。

1．4統(tǒng) 計(jì)分析所得數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用F檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 光鏡下c-fos、c-jun陽性神經(jīng)元胞漿呈棕褐色，著色較深(圖1、2)。眼鏡蛇毒組、生理鹽水組和正常對照組ARC區(qū)均可見c-fos、c-jun陽性神經(jīng)元，生理鹽水組ARC區(qū)c-fos、c-jun陽性神經(jīng)元數(shù)量及平均灰度值較正常對照組無明顯改變(P＞0．05);眼鏡蛇毒組較正常對照組c-fos、c-jun陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯增多(P＜0．01)，平均灰度值明顯降低(P＜0．01，表1)。

2．2 眼鏡蛇毒組、生理鹽水組和正常對照組ARC區(qū)c-fos、c-jun陽性神經(jīng)元均以梭形、橢圓形、圓形為主(圖1、2);生理鹽水組細(xì)胞形態(tài)較正常對照組無明顯改變(P＞0．05);眼鏡蛇毒組梭形、橢圓形、圓形細(xì)胞明顯增多(P＜0．01，表2)。

表1 各組大鼠下丘腦弓狀核中的c-fos和c-jun陽性細(xì)胞數(shù)及平均灰度值(ˉx±s，n=9)Tab 1 The number of c-fos and c-jun positive cells and their average gray value in arcuate nucleus for each group of rats(ˉx±s，n=9)

表2 各組大鼠下丘腦弓狀核中不同形態(tài)的c-fos、c-jun陽性神經(jīng)元(ˉx±s，n=9，單位:個(gè)/mm2)Tab 2 Morphological difference of c-fos and c-jun positive cells in arcuate nucleus for each group of rats(ˉx±s，n=9，count/mm2)

圖1 c-fos蛋白在各組大鼠弓狀核中的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色法，×400)A:正常對照組;B:生理鹽水組;C:眼鏡蛇毒組Fig 1 Expression of c-fos in the rat ARC(Immunohistochemistry staining，×400)A:control group;B:saline group;C:N．a(chǎn)tra venom group

圖2 c-jun蛋白在各組大鼠弓狀核中的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色法，×400)A:正常對照組;B:生理鹽水組;C:眼鏡蛇毒組Fig 2 Expression of c-jun in rat ARCof rats(Immunohistochemistry staining，×400)A:control group;B:saline group;C:N．a(chǎn)tra venom group

3 討論

c-fos是IEG中的一種，在正常情況下，c-fos在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的某些部位如ARC，有著低水平的表達(dá)，當(dāng)機(jī)體受到傷害性刺激時(shí)可在幾分鐘內(nèi)做出反應(yīng)，在外界刺激-轉(zhuǎn)錄耦聯(lián)的信息傳遞過程中起著第三信使的重要作用［4］。c-jun與 c-fos同屬 IEG，cjun與c-fos的表達(dá)是偶聯(lián)的，c-jun蛋白須與c-fos蛋白結(jié)合，從而達(dá)到共同介導(dǎo)目的基因的表達(dá)［5］。我室曾報(bào)道，眼鏡蛇毒對丘腦網(wǎng)狀核c-fos、c-jun的表達(dá)有上調(diào)作用［6－7］。本研究通過免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，各組ARC區(qū)c-fos、c-jun表達(dá)定位均在神經(jīng)元胞漿中，在400倍光鏡視野下觀察，眼鏡蛇毒組較生理鹽水組和正常對照組c-fos、c-jun陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，染色較深。說明眼鏡蛇毒對ARC區(qū)c-fos、c-jun表達(dá)有上調(diào)作用。c-fos、c-jun都是促凋亡基因，動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行c-fos基因表達(dá)與凋亡神經(jīng)元在時(shí)程、分布和數(shù)量上的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)c-fos基因在神經(jīng)元內(nèi)的高表達(dá)與神經(jīng)元的凋亡密切相關(guān)［8］。資料報(bào)道，c-fos、c-jun的高表達(dá)參與細(xì)胞凋亡［9］。本研究發(fā)現(xiàn)眼鏡蛇毒組ARC區(qū)c-fos、c-jun基因表達(dá)增加可能參與了蛇毒引起的細(xì)胞凋亡。其機(jī)制可能是:c-fos和c-jun的產(chǎn)物Fos蛋白和Jun蛋白經(jīng)亮氨酸拉鏈形成聯(lián)合為Fos-Jun二聚體，即轉(zhuǎn)錄因子AP-1特異性與DNA上AP-1結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，啟動后期效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡［10－11］。本實(shí)驗(yàn)還觀察到大鼠ARC區(qū)c-fos、c-jun陽性神經(jīng)元以圓形、梭形和橢圓形為主，眼鏡蛇毒組與生理鹽水組和正常對照組進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，眼鏡蛇毒組大鼠ARC區(qū)三種形態(tài)的細(xì)胞數(shù)量均明顯增多，說明眼鏡蛇毒對大鼠弓狀核內(nèi)三種形態(tài)的c-fos、c-jun陽性神經(jīng)元影響并沒有明顯的選擇性。

眼鏡蛇毒對神經(jīng)肌肉的傳導(dǎo)有阻斷作用，主要作用于突觸后膜，阻斷N2膽堿受體［12］，使乙酰膽堿不能傳遞，從而引起呼吸肌麻痹以致缺氧;還對自主神經(jīng)系統(tǒng)有抑制作用，可抑制頸動脈竇化學(xué)感受器，使缺氧加重導(dǎo)致呼吸衰竭［13］。下丘腦是自主(植物)神經(jīng)的皮質(zhì)下中樞，弓狀核位于下丘腦內(nèi)側(cè)基底部，是下丘腦中的一個(gè)較大的核團(tuán)。弓狀核與下丘腦內(nèi)許多核團(tuán)有纖維聯(lián)系，也與腦干內(nèi)一些植物神經(jīng)元有聯(lián)系，參與對內(nèi)臟、心血管功能活動的調(diào)節(jié)。Banks等通過刺激大鼠頸動脈化學(xué)感受器，發(fā)現(xiàn)ARC參與呼吸活動的調(diào)節(jié)［14］。本實(shí)驗(yàn)觀察到在注射眼鏡蛇毒后大鼠出現(xiàn)了缺氧、呼吸困難等中毒癥狀，推測眼鏡蛇毒組ARC區(qū)c-fos、c-jun表達(dá)上調(diào)可能與呼吸活動的調(diào)節(jié)有關(guān)。

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