中國(guó)圈養(yǎng)食蟹猴TrimCyp基因頻率

田 帥，蒙裕歡，柳明玉，孫 飛，陳軍輝，杜紅麗，王小寧

華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510006

TRIM5α是TRIM蛋白家族的一員，由TRIM5 初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)過(guò)可變剪切產(chǎn)生。人TRIM5α由493個(gè)氨基酸組成，具有 RING、B-box2、coiled-coil以及C'末端的B30.2/SPRY等4個(gè)結(jié)構(gòu)域。TRIM5α蛋白作為逆轉(zhuǎn)錄病毒衣殼特異性的限制因子，具有抗HIV-1感染的作用，且由于它能夠在病毒進(jìn)入細(xì)胞后通過(guò)阻礙其反轉(zhuǎn)錄過(guò)程來(lái)限制病毒感染，故屬于進(jìn)入后限制作用 (Stremlau et al, 2004; Tang et al,2009)。研究表明，TRIM5α的病毒限制作用與各結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和功能緊密相關(guān)。RING結(jié)構(gòu)域具有E3泛素連接酶功能，能夠促進(jìn)TRIM5α自身泛素化，增強(qiáng)蛋白與蛋白之間的相互作用(Mische et al,2005)。B-box2結(jié)構(gòu)域?yàn)橐种撇《灸孓D(zhuǎn)錄所必須，與TRIM5α同源多聚體的相互作用有關(guān) (Mische et al, 2005)，該區(qū)域在一定程度上能夠通過(guò)調(diào)節(jié)TRIM5α高度有序的自我裝配而增強(qiáng)對(duì)HIV-1的限制作用(Diaz-Griffero et al, 2009)。Coiled-coil功能域?qū)RIM5α蛋白二聚體的形成和穩(wěn)定有重要作用，只有 TRIM5α同源二聚體才具有抗慢病毒的功能(Stremlau et al, 2004)，且coiled-coil結(jié)構(gòu)域也參與決定抗病毒特異性，對(duì)TRIM5α特異性識(shí)別和結(jié)合病毒衣殼有一定作用(Maillard et al, 2010)。SPRY/B30.2結(jié)構(gòu)域的V1、V2和V3三個(gè)可變區(qū)域?qū)Σ《疽職ぬ禺愋跃哂兄匾饔?。B30.2區(qū)域的這3個(gè)可變區(qū)域均可形成 Loop結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)有利于TRIM5α蛋白與病毒特異性識(shí)別與結(jié)合 (Ohkura et al, 2006)。該區(qū)域的N端部分對(duì)抗HIV-1有決定作用 (Yap et al, 2005)，C末端SPRY/B30.2結(jié)構(gòu)域是抗逆轉(zhuǎn)錄病毒所必需的，也是識(shí)別結(jié)合HIV-1衣殼必不可少的關(guān)鍵區(qū)域 (Lim et al, 2010)。在HIV-1感染靶細(xì)胞的早期階段，細(xì)胞內(nèi)的TRIM5α蛋白通過(guò)B30.2結(jié)構(gòu)域與入侵的HIV-1衣殼蛋白相互作用，并且在RING結(jié)構(gòu)域E3泛素連接酶的作用下，通過(guò)促進(jìn)HIV-1脫殼或加速衣殼蛋白降解來(lái)阻礙反轉(zhuǎn)錄過(guò)程的順利進(jìn)行，從而抑制HIV-1后期逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的產(chǎn)生 (Stremlau et al, 2006)。

TRIMCyp蛋白首先在鷹猴 (Aotus trivirgatus)中被發(fā)現(xiàn)，鷹猴體內(nèi)表達(dá)的一種融合蛋白TRIMCyp能夠限制HIV-1感染。TRIMCyp蛋白保留了TRIM蛋白家族N末端的RBCC三模序列，只是TRIM5α蛋白的B30.2結(jié)構(gòu)域被親環(huán)素CypA (Cyclophilin A)代替。在鷹猴中，CypA基因通過(guò)逆轉(zhuǎn)座作用插入TRIM5基因的第 7和第 8外顯子之間，形成TRIM5-CypA融合基因，TRIMCyp同樣通過(guò)形成同源二聚體而發(fā)揮限制作用 (Nisole et al, 2004; Sayah et al, 2004)。鷹猴 TRIMCyp以與其他靈長(zhǎng)類TRIM5α相似的機(jī)制限制 HIV-1感染，都能夠在反轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)入靶細(xì)胞后的早期階段限制其感染。親環(huán)蛋白CypA是一種肽基脯氨酰異構(gòu)酶，能夠結(jié)合HIV-1衣殼表面富含脯氨酸的回環(huán)結(jié)構(gòu)，這種相互作用增加了人對(duì)HIV-1的易感性，同時(shí)也增強(qiáng)了非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物限制 HIV-1的活性 (Sokolskaja &Luban, 2006)。TRIMCyp除了在新大陸猴鷹猴體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)以外，也在舊大陸猴體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，至少4種猴子體內(nèi)有 TRIMCyp融合蛋白：印度恒河猴(Macaca mulatta)、平頂猴 (Macaca nemestrina)、熊猴(Macaca assamensis)以及食蟹猴(Macaca fascicularis)(Brennan et al, 2008; Cao et al, 2011;Liao et al, 2007; Newman et al, 2008; Virgen et al,2008; Wilson et al, 2008)，這些融合基因均由 CypA基因通過(guò)L1介導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)座作用插入TRIM5 基因的3’UTR而形成,它們均能經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生由TRIM5α的2～6號(hào)外顯子和完整CypA結(jié)構(gòu)域組成的 TRIMCyp蛋白。恒河猴和平頂猴的 TRIMCyp不能限制HIV-1感染，卻能夠限制HIV-2和FIV的活性(Brennan et al, 2008; Liao et al, 2007; Newman et al, 2008; Virgen et al, 2008; Wilson et al, 2008)。最新研究表明，食蟹猴中的TRIMCyp多態(tài)性具有功能差異 (Dietrich et al, 2011)，TRIMCyp主要單體型(DK)即TRIMCyp融合蛋白CypA結(jié)構(gòu)域中的第66位天冬氨酸(D)和第 143位賴氨酸(K)可限制 HIV-1的作用，但不能限制HIV-2。TRIMCyp次要單體型(NE)即TRIMCyp融合蛋白CypA結(jié)構(gòu)域中的第66位天冬酰胺(N)和第 143位谷氨酸(E)能夠限制HIV-2，卻不能限制HIV-1感染 (Saito et al, 2012a)，兩種單體型功能完全相反，提示TRIMCyp的多態(tài)性對(duì)抗病毒效應(yīng)有一定的影響，因此攜帶TRIMCyp NE單體型的食蟹猴有可能構(gòu)建成為HIV-1感染的動(dòng)物模型。

TRIMCyp的等位基因頻率存在地域偏差，雖然食蟹猴 TRIMCyp基因的頻率在東南亞不同國(guó)家或地區(qū)已經(jīng)被初步調(diào)查 (Berry et al, 2012; Dietrich et al, 2011; Saito et al, 2012a; Saito et al, 2012b)(表 1)，但是，中國(guó)大陸食蟹猴養(yǎng)殖場(chǎng)的 TRIMCyp基因頻率還未被明確闡明，本研究對(duì)中國(guó)5個(gè)省11個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)共 1 594個(gè)食蟹猴繁殖種群隨機(jī)樣本中的TRIMCyp基因頻率進(jìn)行了篩查研究，以期為進(jìn)一步開展食蟹猴HIV-1動(dòng)物模型和HIV-1發(fā)病機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

表1 東南亞不同地區(qū)食蟹猴TRIMCyp等位基因頻率Table 1 Frequency of TRIMCyp alleles of cynomolgus macaques in Southeast Asia

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源與DNA抽提

本研究在廣東、廣西、云南、海南和江蘇5個(gè)省 11個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的食蟹猴繁殖種群中隨機(jī)采集了 1 594個(gè)血樣，EDTA抗凝于-20 ℃保存?zhèn)溆??；蚪MDNA抽提試劑盒購(gòu)自北京普博生物科技有限公司，按照說(shuō)明書進(jìn)行基因組DNA提取。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

分別根據(jù)TRIM5α第8外顯子和3'UTR序列設(shè)計(jì)CypA篩查引物，引物為TrimcypF: ATGACTCTG TGCTCACCAAG，TrimcypR：AACTCTAGTCACC CTACTATG，由上海生工生物公司合成。

1.3 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

以基因組 DNA為模板，通過(guò) PCR擴(kuò)增篩查CypA插入情況，并對(duì)帶有CypA個(gè)體進(jìn)行測(cè)序。PCR擴(kuò)增所用Taq酶為TaKaRa LA Taq酶(寶生物工程(大連)有限公司)。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃40 s，退火溫度59 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。CypA插入片段的測(cè)序驗(yàn)證：回收1 000 bp和1 700 bp的PCR產(chǎn)物凝膠，送交深圳華大基因科技有限公司 (廣州)進(jìn)行上、下游引物測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 PCR和測(cè)序

PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1，PCR產(chǎn)物凝膠回收后的上、下游引物測(cè)序結(jié)果與預(yù)期序列一致。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳情況Figure 1 Electrophoresis image of PCR product

2.2 基因分型和等位基因頻率

從5個(gè)省11個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)共1 594個(gè)食蟹猴樣本統(tǒng)計(jì)來(lái)看，共有379個(gè)個(gè)體含有TRIMCyp融合基因，占總數(shù)的 23.78%，其中純合子47個(gè)(12.40%)，雜合子332個(gè)(87.60%)。TRIM5α和TRIMCyp基因頻率具體結(jié)果見表 2。在我們篩查的中國(guó)圈養(yǎng)食蟹猴中，TRIM5α基因頻率顯著高于TRIMCyp融合基因頻率，分別是86.64%和13.36%；TRIMCyp融合基因頻率(7.65%～19.79%)高于毛里裘斯食蟹猴的TRIMCyp融合基因頻率(0%)，顯著低于印度尼西亞、菲律賓和馬來(lái)西亞各國(guó)的 TRIMCyp融合基因頻率(34.85%～100%)，而與印度尼西亞 (Saito et al,2012b)和中印半島食蟹猴 TRIMCyp融合基因頻率無(wú)明顯差異(表1)。

表2 中國(guó)圈養(yǎng)食蟹猴TRIM5α與TRIMCyp基因頻率統(tǒng)計(jì)Table 2 Frequencies of cynomolgus TRIM5 alpha and TRIMCyp genes in China

2.3 TRIMCyp單倍型統(tǒng)計(jì)

將含有TRIMCyp融合基因的個(gè)體進(jìn)行CypA測(cè)序，并對(duì)CypA第66位氨基酸(D/N)和143位氨基酸(K/E)的個(gè)體進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示NE單倍型食蟹猴個(gè)體很少，僅20個(gè)個(gè)體，其中只有一個(gè)是NE單倍型純合子(表 3)，且中國(guó)圈養(yǎng)食蟹猴 NE單倍型頻率 (4.93%)也顯著低于東南亞三個(gè)國(guó)家食蟹猴NE單倍型頻率 (11.1%～14.3%)(Saito et al, 2012a)。

表3 中國(guó)圈養(yǎng)食蟹猴TRIMCyp DK和NE單倍型頻率Table 3 Frequencies of cynomolgus TRIMCyp haplotypes DK&NE in China

3 討論

本研究初步篩查了我國(guó)境內(nèi)食蟹猴 TRIMCyp融合基因和 CypA單倍型的頻率，而對(duì)食蟹猴TRIMCyp融合基因?qū)Σ煌孓D(zhuǎn)錄病毒的抗毒效應(yīng)未進(jìn)一步研究。靈長(zhǎng)類動(dòng)物 TRIMCyp融合基因從發(fā)現(xiàn)至今，研究者除了對(duì)新大陸猴鷹猴 TRIMCyp融合蛋白限制HIV-1復(fù)制的作用機(jī)制有一定了解以外，舊大陸猴 TRIMCyp融合蛋白不能限制 HIV-1感染的具體機(jī)制到現(xiàn)在還沒有確切結(jié)論。最近發(fā)現(xiàn)CypA上幾個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性會(huì)影響TRIMCyp融合蛋白的限制逆轉(zhuǎn)錄病毒活性，其中CypA結(jié)構(gòu)域中第54位氨基酸的單點(diǎn)突變(H54R)決定了食蟹猴TRIMCyp融合蛋白限制 HIV-1和 FIV的能力(Ylinen et al, 2010)。進(jìn)一步研究除證實(shí)了該結(jié)論以外，還發(fā)現(xiàn)TRIMCyp融合蛋白CypA結(jié)構(gòu)域中的第 66位和 143位氨基酸與印度尼西亞食蟹猴TRIMCyp融合蛋白的限制逆轉(zhuǎn)錄病毒活性密切相關(guān)，其中66位為D，143位為K的突變能夠限制HIV-1復(fù)制 (Dietrich et al, 2011)。由于不同靈長(zhǎng)類動(dòng)物來(lái)源的TRIMCyp融合蛋白在其CypA結(jié)構(gòu)域中的許多氨基酸位點(diǎn)存在差異，導(dǎo)致其 TRIMCyp融合蛋白與不同逆轉(zhuǎn)錄病毒衣殼蛋白Gag的識(shí)別和結(jié)合能力也存在差異，繼而導(dǎo)致其抑制活性上的差異 (Cao et al, 2012)。在我國(guó)境內(nèi)含TRIMCyp融合基因的食蟹猴，絕大部分是以TRIM5α/TRIMCyp雜合子的形式出現(xiàn) (87.60%)，在東南亞不同國(guó)家或地區(qū)的 TRIM5α/TRIMCyp雜合子頻率是 53.16%；而TRIMCyp的基因頻率甚至高達(dá)100%(Philippines)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于中國(guó)圈養(yǎng)的平均水平 (13.36%)。原因可能是由于前者是建立于1978年的封閉群。同時(shí)，Saito et al (2012a)對(duì)印度尼西亞食蟹猴的兩次研究顯示不同的 TRIMCyp融合基因頻率 (15.00%和34.85%)，而在毛里裘斯食蟹猴中則未發(fā)現(xiàn)TRIMCyp融合基因。另外，我們發(fā)現(xiàn)在中國(guó)圈養(yǎng)的NE單倍型食蟹猴個(gè)體極少，NE單倍型頻率(4.93%)也顯著低于東南亞三個(gè)國(guó)家的食蟹猴NE單倍型頻率 (11.1%～14.3%)。因此，如果需要構(gòu)建中國(guó)圈養(yǎng)食蟹猴HIV-1感染模型的資源群，需要大量篩查中國(guó)圈養(yǎng)攜帶 TRIMCyp融合基因的食蟹猴，并根據(jù)TRIMCyp單倍型來(lái)構(gòu)建封閉群。另外，研究TRIMCyp不同單倍型與HIV-1和HIV-2感染的相關(guān)性，有助于進(jìn)一步揭示HIV的感染機(jī)制。TRIMCyp融合基因的發(fā)現(xiàn)和研究為 HIV-1研究提供策略基礎(chǔ)，為探討TRIMCyp與其他抗HIV-1固有免疫分子的相互關(guān)系提供新思路，并為建立更理想的HIV-1/AIDS動(dòng)物模型提供科學(xué)依據(jù)。

Berry NJ, Marzetta F, Towers GJ, Rose NJ. 2012. Diversity of TRIM5α and TRIMcyp sequences in cynomolgus macaques from different geographical origins. Immunogenetics, 64(4): 267-278.

Brennan G, Kozyrev Y, Hu SL. 2008. TRIMcyp expression in old world primates macaca nemestrina and macaca fascicularis. Proceedings of the Natlional Academy of Sciences of the United States of America, 105(9):3569-3574.

Cao G, Liu FL, Zhang GH, Zheng YT. 2012. The primate TRIMcyp fusion genes and mechanism of restricting retroviruses replication. Zoological Research, 33(1): 99-107. [曹光, 劉豐亮, 張高紅, 鄭永唐. 2012. 靈長(zhǎng)類動(dòng)物TRIMCyp融合基因模式及對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制的限制作用. 動(dòng)物學(xué)研究, 33(1): 99-107.]

Cao G, Nie WH, Liu FL, Kuang YQ, Wang JH, Su WT, Zheng YT. 2011.Identification of the TRIM5/TRIMcyp heterozygous genotype in macaca assamensis. Zoological Research, 32(1): 40-49. [曹光, 佴文惠, 劉豐亮,況軼群, 王金煥, 蘇偉婷, 鄭永唐. 2011. 熊猴存在TRIM45/TRIMCyp雜合子基因型. 動(dòng)物學(xué)研究, 32(1): 40-49.]

Diaz-Griffero F, Qin XR, Hayashi F, Kigawa T, Finzi A, Sarnak Z, Lienlaf M, Yokoyama S, Sodroski J. 2009. A b-box 2 surface patch important for trim5alpha self-association, capsid binding avidity, and retrovirus restriction.Journal of Virology, 83(20): 10737-10751.

Dietrich EA, Brennan G, Ferguson B, Wiseman RW, O'Connor D, Hu SL.2011. Variable prevalence and functional diversity of the antiretroviral restriction factor trimcyp in macaca fascicularis. Journal of Virology, 85(19):9956-9963.

Liao CH, Kuang YQ, Liu HL, Zheng YT, Su B. 2007. A novel fusion gene,trim5-cyclophilin a in the pig-tailed macaque determines its susceptibility to hiv-1 infection. AIDS, 21(Suppl 8): S19-S26.

Lim SY, Chan T, Gelman RS, Whitney JB, O'Brien KL, Barouch DH,Goldstein DB, Haynes BF, Letvin NL. 2010. Contributions of Mamu- A*01 status and TRIM 5 allele expression, but not CCL3L copy number variation,to the control of sivmac251 replication in indian-origin rhesus monkeys.PLoS Genet, 6(6): e1000997.

Maillard PV, Ecco G, Ortiz M, Trono D. 2010. The specificity of TRIM5 alpha-mediated restriction is influenced by its coiled-coil domain. Journal of Virology, 84(11): 5790-5801.

Mische CC, Javanbakht H, Song B, Diaz-Griffero F, Stremlau M, Strack B,Si Z, Sodroski J. 2005. Retroviral restriction factor TRIM5alpha is a trimer.Journal of Virology, 79(22): 14446-14450.

Newman RM, Hall L, Kirmaier A, Pozzi LA, Pery E, Farzan M, O'Neil SP,Johnson W. 2008. Evolution of a TRIM5-cypa splice isoform in old world monkeys. PLoS Pathog, 4(2): e1000003.

Nisole S, Lynch C, Stoye JP, Yap MW. 2004. A TRIM5-cyclophilin a fusion protein found in owl monkey kidney cells can restrict hiv-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101(36):13324-13328.

Ohkura S, Yap MW, Sheldon T, Stoye JP. 2006. All three variable regions of the TRIM5alpha b30.2 domain can contribute to the specificity of retrovirus restriction. Journal of Virology, 80(17): 8554-8565.

Saito A, Kono K, Nomaguchi M, Yasutomi Y, Adachi A, Shioda T, Akari H,Nakayama EE. 2012a. Geographical, genetic and functional diversity of antiretroviral host factor trimcyp in cynomolgus macaque (Macaca fascicularis). Journal of General Virology, 93(Pt 3): 594-602.

Saito A, Kawamoto Y, Higashino A, Yoshida T, Ikoma T, Suzaki Y, Ami Y,Shioda T, Nakayama EE, Akari H. 2012b. Allele frequency of antiretroviral host factor trimcyp in wild-caught cynomolgus macaques (Macaca fascicularis). Frontiers in Microbiology, 3: 314.

Sayah DM, Sokolskaja E, Berthoux L, Luban J. 2004. Cyclophilin a retrotransposition into trim5 explains owl monkey resistance to hiv-1.Nature, 430(6999): 569-573.

Sokolskaja E, Luban J. 2006. Cyclophilin, TRIM5, and innate immunity to hiv-1. Current Opinion Microbiology, 9(4): 404-408.

Stremlau M, Owens CM, Perron MJ, Kiessling M, Autissier P, Sodroski J.2004. The cytoplasmic body component trim5alpha restricts hiv-1 infection in old world monkeys. Nature, 427(6977): 848-853.

Stremlau M, Perron M, Lee M, Li Y, Song B, Javanbakht H, Diaz-Griffero F,Anderson DJ, Sundquist WI, Sodroski J. 2006. Specific recognition and accelerated uncoating of retroviral capsids by the trim5alpha restriction factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America, 103(14): 5514-5519.

Tang X, Kuang YQ, Zheng YT. 2009. Research advance of TRIM5 α on structure and restriction mechanism to hiv-1 replication. Chinese Journal of

Virology, 25(2): 148-153. [湯霞, 況軼群, 鄭永唐. 2009. TRIM5α分子結(jié)構(gòu)和限制HIV-1復(fù)制機(jī)制的研究進(jìn)展. 病毒學(xué)報(bào), 25(2): 148-153.]

Virgen CA, Kratovac Z, Bieniasz PD, Hatziioannou T. 2008. Independent genesis of chimeric TRIM5-cyclophilin proteins in two primate species.Proceedings of the National Academy of the Scienes of the United States of America, 105(9): 3563-3568.

Wilson SJ, Webb BL, Ylinen LM, Verschoor E, Heeney JL, Towers GJ.2008. Independent evolution of an antiviral trimcyp in rhesus macaques.Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of American, 105(9): 3557-3562.

Yap MW, Nisole S, Stoye JP. 2005. A single amino acid change in the spry domain of human Trim5alpha leads to hiv-1 restriction. Current Bioloinggy,15(1): 73-78.

Ylinen LMJ, Price AJ, Rasaiyaah J, Hué S, Rose NJ, Marzetta F, James LC,Towers GJ. 2010. Conformational adaptation of asian macaque trimcyp directs lineage specific antiviral activity. PLoS Pathog, 6(8): e1001062.