滇池金線鲃（Sinocyclocheilus grahami）耳石的茜素紅及茜素絡(luò)合物標(biāo)志

趙亞鵬, 潘曉賦, 楊君興,*, 陳小勇,*, 王曉愛(ài), 李再云

1. 中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所 遺傳資源與進(jìn)化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650223

2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

滇池金線鲃（Sinocyclocheilus grahami）隸屬鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinidae）金線鲃屬（Sinocyclocheilus），分布于滇池流域，為國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，同時(shí)，已被列入《中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書（魚類）》（Yue et al，1998）。自上世紀(jì)80年代起，由于環(huán)境污染、棲息地破壞及濫捕濫撈等原因，滇池金線鲃數(shù)量急劇下降（Chen et al，2001）。目前，滇池金線鲃的人工繁殖已經(jīng)成功（Yang et al，2007），并于2009年開始實(shí)施人工增殖放流，且放流規(guī)格通常不超過(guò)5 cm。一些常規(guī)標(biāo)志方法，如穿刺標(biāo)記（percutaneous tags）、可視性植入標(biāo)記（visible implant tags）及線碼標(biāo)記（coded wire tags）等易對(duì)放流規(guī)格滇池金線鲃造成傷害且成本較高。利用能與鈣結(jié)合的化學(xué)染料溶液浸泡早期魚苗，從而在耳石上形成相應(yīng)標(biāo)志環(huán)的耳石標(biāo)記法，能夠一次性標(biāo)記大量早期魚苗，操作簡(jiǎn)單，對(duì)魚體損傷小，且標(biāo)記形成后，不會(huì)被代謝吸收，理論上能保留終身（van der Walt & Faragher，2003），已被應(yīng)用于香魚（Plecoglossus altivelis）人工增殖放流（Tsukamoto，1988）及珊瑚魚類的種群生態(tài)學(xué)研究（Jones et al，1999）。常用化學(xué)染料有：茜素絡(luò)合物（alizarin complexone，ALC）、茜素紅（alizarin red S，ARS）及鹽酸四環(huán)素（oxytetracycline，OTC）等，由于對(duì)化學(xué)染料的耐受性和敏感性不同（Fu et al，2005；Jin et al，2011；Tsukamoto，1988），不同魚種的最佳浸泡條件也不相同。本研究旨在尋找浸泡標(biāo)記滇池金線仔稚魚的最佳條件，為其早期魚苗的大規(guī)模標(biāo)記提供技術(shù)支持，并為放流后的評(píng)估工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚來(lái)源及管理

6日齡（60尾）、20日齡（60尾）及90日齡（80尾）健康滇池金線鲃魚苗均來(lái)自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所珍稀魚類保育研究基地。親本系2005年5～7月采自滇池流域的嵩明縣牧羊河。 6日齡組魚苗投喂蛋黃漿及黃豆?jié){，20日齡組魚苗投喂輪蟲，90日齡魚苗投喂破碎的111鯉魚飼料（顆粒直徑≤0.5 mm，通威股份有限公司昆明分公司）（Pan et al，2009）。

1.2 浸泡溶液配置

實(shí)驗(yàn)采用分析純茜素絡(luò)合指示劑（上海冠翔生物技術(shù)有限公司，3952-78-1）及茜素紅（上海冠翔生物技術(shù)有限公司，130-22-3）。為提高溶解度，先由蒸餾水配置成為500 mg/L的母液，然后用曝氣地下水稀釋至所需濃度。

1.3 實(shí)驗(yàn)方案

兩種化學(xué)染料的浸泡液濃度、浸泡時(shí)間及樣本大小見(jiàn)表1，表2，各試驗(yàn)組樣本數(shù)為10尾。實(shí)驗(yàn)期間將樣本置于溫度為16～18 ℃的房間，浸泡實(shí)驗(yàn)開始前 24 h不投餌，浸泡結(jié)束更換清水后恢復(fù)投餌，暫養(yǎng)一段時(shí)間后用丁香油麻醉致死后摘取耳石并觀察。

1.4 耳石摘取及觀察

將樣本魚體置于雙筒解剖鏡下，以解剖針將耳石取出，置于玻片上，清水和酒精清洗及二甲苯透明后，由透明指甲油封存。由于星耳石在仔魚出膜后～30 d出現(xiàn)，矢耳石在出膜30 d后開始呈現(xiàn)狹長(zhǎng)生長(zhǎng)，90 d后在剝?nèi)r(shí)易破碎，故兩者均不宜作為標(biāo)記檢測(cè)載體，而應(yīng)以微耳石作為檢測(cè)對(duì)象。光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡（選擇510～560 nm綠色激光作為激發(fā)光）觀察標(biāo)記效果（Fu et al，2005），且標(biāo)記效果分為無(wú)、可見(jiàn)、清晰及強(qiáng)烈四個(gè)等級(jí)。

2 結(jié)果

2.1 浸泡液安全濃度

茜素紅溶液濃度對(duì)仔稚魚的影響結(jié)果顯示（表1），濃度50～150 mg/L，浸泡4～36 h條件下，除50 mg/L，4 h實(shí)驗(yàn)組中因操作不當(dāng)造成1尾死亡外，其他各組均存活率均為100%。當(dāng)濃度至200 mg/L時(shí)，90日齡稚魚出現(xiàn)死亡，24 h和36 h組死亡率分別為30%（n=10）和20%（n=10）。

表1 茜素紅溶液浸泡標(biāo)記方案及標(biāo)記效果Table 1 Details of immersion experiments using ARS and their subsequent marking results

茜素絡(luò)合物溶液浸泡標(biāo)記結(jié)果顯示（表2），濃度50～100 mg/L，浸泡4～8 h，6日齡仔魚成活率為100%（n=10），當(dāng)濃度達(dá)到150 mg/L時(shí)，仔魚開始死亡，浸泡8 h，死亡率達(dá)30%（n=10）。為實(shí)驗(yàn)對(duì)象時(shí)，濃度50～150 mg/L，浸泡12～24 h，對(duì)20及90日齡仔稚魚的生存沒(méi)有影響，且在該濃度下，浸泡時(shí)間延長(zhǎng)至3 d，魚苗仍能存活。當(dāng)濃度＞200 mg/L時(shí)，90日齡稚魚全部死亡。

表2 茜素絡(luò)合物溶液標(biāo)記方案及標(biāo)記效果Table 2 Details of immersion experiments using ALC and their subsequent marking results

2.2 標(biāo)記效果

2.2.1 茜素紅浸泡效果

可見(jiàn)光下，普通光學(xué)顯微鏡觀察茜素紅溶液浸泡標(biāo)記的滇池金線鲃耳石，可見(jiàn)紫紅色標(biāo)記環(huán)帶，且標(biāo)記強(qiáng)度與個(gè)體日齡、浸泡濃度及浸泡時(shí)間有關(guān)。6日齡仔魚，50 mg/L、4 h實(shí)驗(yàn)組可觀察到可辨識(shí)微弱標(biāo)記環(huán)，100及150 mg/L試驗(yàn)組均能形成清晰標(biāo)記環(huán)。20日齡仔魚，50 mg/L、12 h試驗(yàn)組未見(jiàn)標(biāo)記環(huán)，50 mg/L、2 h及100 mg/L，12 h實(shí)驗(yàn)組僅見(jiàn)微弱標(biāo)記環(huán)，150 mg/L、24 h試驗(yàn)組標(biāo)志環(huán)顏色最為強(qiáng)烈（圖A，B）。90日齡稚魚，50 mg/L未見(jiàn)標(biāo)志環(huán)，100～200 mg/L可見(jiàn)標(biāo)記環(huán)。熒光顯微鏡（綠色激發(fā)光）觀察，各實(shí)驗(yàn)組均可見(jiàn)猩紅色熒光反應(yīng)，且標(biāo)記個(gè)體日齡越小、浸泡濃度越大及浸泡時(shí)間越長(zhǎng)，其顏色越強(qiáng)烈。

圖1 茜素紅各類標(biāo)記方案對(duì)仔魚微耳石的標(biāo)記效果Figure 1 Marking results of immersion experiments using ARS

圖2 茜素絡(luò)合物對(duì)仔魚微耳石的標(biāo)記效果Figure 1 Marking results of immersion using ALC

2.2.2 茜素絡(luò)合物浸泡效果

可見(jiàn)光下，普通光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果顯示，茜素絡(luò)合物溶液浸泡標(biāo)記的仔稚魚耳石呈現(xiàn)與茜素紅相同的紫紅色標(biāo)記環(huán)，且相對(duì)于茜素紅，滇池金線鲃仔稚魚對(duì)茜素絡(luò)合物溶液更加敏感。6日齡仔魚，50 mg/L，4 h實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)清晰標(biāo)記環(huán)。20日齡和90日齡魚苗，50～150 mg/L實(shí)驗(yàn)組均可見(jiàn)紫紅色標(biāo)記環(huán)。熒光顯微鏡下（510～560 nm綠色激發(fā)光），各實(shí)驗(yàn)組標(biāo)記帶均呈猩紅色銀光熒光反應(yīng)。

3 討論

3.1 檢測(cè)條件

可見(jiàn)光及綠色激光下均能觀察到茜素紅和茜素絡(luò)合物在耳石上所形成的標(biāo)記環(huán)。綠色激光下，標(biāo)記環(huán)內(nèi)部區(qū)域呈猩紅色，與浸泡標(biāo)記后生長(zhǎng)的耳石部分形成強(qiáng)烈對(duì)比，可見(jiàn)光下，僅能觀察到深紅色的標(biāo)記環(huán)；綠色激光下，不能觀察到耳石的生長(zhǎng)輪，可見(jiàn)光下，可觀察到標(biāo)記環(huán)前后形成的生長(zhǎng)輪；形成可見(jiàn)光下可被觀察到的標(biāo)記環(huán)所需的浸泡強(qiáng)度高于綠色激光。因此，可見(jiàn)光檢測(cè)的方法更適用于耳石生長(zhǎng)輪生長(zhǎng)規(guī)律的研究，而綠色激光檢測(cè)方法更適用于放流標(biāo)記。

3.2 浸泡條件及化學(xué)染料

浸泡濃度和浸泡時(shí)間均可影響標(biāo)記效果。相同浸泡濃度下，浸泡時(shí)間越長(zhǎng)，效果越好，同時(shí)，為提高標(biāo)記效率，浸泡時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。6日齡仔魚，浸泡時(shí)間以8 h為宜，20 和90日齡魚苗浸泡時(shí)間以24 h為宜。在安全濃度范圍內(nèi)，浸泡液濃度越高，標(biāo)記效果越好。為使在可見(jiàn)光下標(biāo)記效果達(dá)到清晰易于辨認(rèn)的級(jí)別，標(biāo)記6日齡仔魚時(shí)，茜素紅和茜素絡(luò)合物的浸泡液濃度需達(dá)到50 mg/L；標(biāo)記20日齡仔魚時(shí)，兩種浸泡液濃度要分別達(dá)到 100 mg/L和50 mg/L；標(biāo)記90日齡稚魚時(shí)，濃度要分別達(dá)到150 mg/L和100 mg/L。而在綠色激光下，50 mg/L的茜素紅和茜素絡(luò)合物溶液浸泡6、20及90日齡魚苗，便可見(jiàn)清晰標(biāo)記，且以上浸泡條件均不影響仔魚生存。若以放流標(biāo)記為目的，50 mg/L為茜素紅和茜素絡(luò)合物溶液的合適濃度，而不超過(guò)20日齡的魚苗，還可適當(dāng)降低浸泡濃度。相同濃度下，茜素絡(luò)合物標(biāo)記效果優(yōu)于茜素紅，但茜素紅更具價(jià)格優(yōu)勢(shì)，綜合考慮茜素紅為標(biāo)記滇池金線鲃的最佳化學(xué)染料。

3.3 標(biāo)記規(guī)格

Secor et al（1991）認(rèn)為, 不同魚齡個(gè)體之間標(biāo)記效果的差異也許和代謝速率有關(guān)，低齡魚代謝率高于高齡魚，更易吸收化學(xué)染料并形成標(biāo)記。滇池金線鲃標(biāo)記試驗(yàn)中，個(gè)體越小，越易形成標(biāo)記環(huán)。相同浸泡強(qiáng)度下，20日齡仔魚耳石標(biāo)記效果優(yōu)于90日齡稚魚。個(gè)體越小，浸泡標(biāo)記期間的飼養(yǎng)密度就越大，6日齡仔魚飼養(yǎng)密度遠(yuǎn)高于90日齡稚魚，大大提高了熒光染料的利用率。因此，從標(biāo)記效果、浸泡效率及熒光染料利用率等方面來(lái)看，相較 20及90日齡仔稚魚，6日齡仔魚更適宜于標(biāo)記放流。

綜上所述，茜素紅和茜素絡(luò)合物均適用于滇池金線鲃仔稚魚耳石標(biāo)記，但茜素紅更具價(jià)格優(yōu)勢(shì)，更適用于大規(guī)模標(biāo)記放流。浸泡標(biāo)記時(shí)，標(biāo)記環(huán)大小取決于浸泡時(shí)仔稚魚耳石的大小，通過(guò)標(biāo)記不同日齡仔稚魚來(lái)控制標(biāo)記環(huán)的大小，從而區(qū)分不同的放流群體，是今后的研究重點(diǎn)之一。

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