圍產(chǎn)期克羅米酚處理改變雄性小鼠性取向

何鳳琴，張恒睿

1. 西安文理學(xué)院 生物技術(shù)學(xué)院，陜西 西安 710065

2. 中南大學(xué) 交通運輸學(xué)院，湖南 長沙 410012

生殖季節(jié)，雌、雄哺乳動物通常會尋求與異性同種交配，但同時也存在對同性產(chǎn)生興趣的個體。研究發(fā)現(xiàn)性取向和性行為與大腦發(fā)育關(guān)鍵時期類固醇激素控制神經(jīng)發(fā)育的機制有關(guān)（Bakker，2003）。激素作用導(dǎo)致非人靈長類和嚙齒類大腦發(fā)育出現(xiàn)性差的最大敏感時期為圍產(chǎn)期，即產(chǎn)前及產(chǎn)后一周（Viemari et al，2003；Baum，1979；Wallen，2005）。該階段，性激素對腦結(jié)構(gòu)及功能產(chǎn)生不可逆影響，較高濃度雌激素產(chǎn)生雄性化的腦，使個體成年后出現(xiàn)雄性化性行為，如較多的爬跨、插入及攻擊行為等，且性取向為雌性，而較低濃度雌激素則產(chǎn)生雌性化的腦，個體成年后出現(xiàn)雌性化接受性性行為，如脊柱前凸等，且性取向為雄性（Cohen-Bendahan et al，2005）。例如，有研究顯示，若雌性大鼠在大腦發(fā)育期暴露于高濃度類固醇激素或激素代謝物，則成體不僅缺乏脊柱前凸行為（Barraclough &Gorski，1961），且產(chǎn)生同性取向（Henley et al，2009）。同樣，雌性小鼠若產(chǎn)前暴露于雌激素，成年時則將顯示完全去雌性化，脊柱前凸行為減少，但性取向不明確（Brock & Bakker，2011）。

在腦性二型分化的分子機制研究中，克羅米酚（clomiphene citrate）作為雌激素受體阻斷劑（Giannakopoulou et al，2001），可抑制雌激素活性。新生雄性大鼠經(jīng)克羅米酚處理后，其成年個體的生殖生理和性行為將受到長期影響（Pereira et al，2003）。但克羅米酚與雄性動物性取向間的關(guān)系尚未見報道。此外，除圍產(chǎn)期外，青春期也是性激素影響神經(jīng)發(fā)育的關(guān)鍵時期，該時期性激素對神經(jīng)結(jié)構(gòu)的影響建立于發(fā)育早期性激素對大腦性差的影響。在青春期發(fā)育階段被閹割或給予抗雄激素處理的雄性將顯示比其他雄性更加典型的雌性化行為，如較少的少年時期野蠻行為、較多的成年期脊柱前凸行為及減少的攻擊行為等（Cohen-Bendahan et al，2005），但其對性取向的影響目前尚不明確，需借助于同性取向模型進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

性成熟健康雌、雄昆明小鼠各40只（體重20～23 g），購于西安交大醫(yī)學(xué)院，飼養(yǎng)于西安文理學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院鼠房。室溫24～26 ℃，自然光照（12L:12D），飼養(yǎng)箱（40×30×20 cm）以鋸木作底物，飼喂常規(guī)鼠飼料。

1.2 實驗過程

1.2.1 圍產(chǎn)期藥物處理

雌、雄小鼠合籠3 d后，檢查雌鼠陰道是否出現(xiàn)陰道栓（表明動物處于動情期并發(fā)生過交配行為），從第四天起計算懷孕天數(shù)（He et al，2008），鼠類一般懷孕21 d，即從合籠到分娩共25 d。根據(jù)皮下注射藥物時長將實驗動物分為4組，第一、二組分別于分娩當(dāng)天對雄性幼鼠連續(xù)注射藥物3 d和6 d，第三、四組首先對孕鼠分別注射藥物3 d和6 d，以期通過胎盤血液循環(huán)將所注射藥物作用于胎兒，待分娩后再分別對雄性幼鼠連續(xù)注射藥物6 d和7 d，即第三、四組藥物處理時間分別為9 d和14 d。每一組根據(jù)所注射藥物的不同又分為對照組（注射芝麻油，MC，n=10），克羅米酚-芝麻油混合組（MT1，n=10）（clomiphene citrate，C 6272-1G，Sigma，2 mg/kg），及雌二醇組（MT2，n=10）（β-Estradiol，E 2758-250MG，Sigma，5 mg/kg）。第三、四組中每小組孕鼠的藥物注射劑量均為1 mL/次，每組新生小鼠的藥物注射劑量均為0.3 mL/次。觀察各組3月齡后代的性取向行為。

1.2.2 青春期閹割處理

九只孕鼠不作藥物處理，自然分娩，對21日齡雄性F1代進行閹割并與親代分離。閹割F1代分為對照組（假手術(shù)組，n=10）和實驗組（去除睪丸組，n=10）。觀察3月齡F1代的性取向行為。

1.3 實驗刺激

雄性刺激鼠為雙側(cè)睪丸下降，雌性刺激鼠通過皮下注射雌二醇苯甲酸（0.00075 mg/g，實驗前24 h）和孕激素（0.015 mg/g，實驗前4～6 h）進入發(fā)情期（He et al，2008），取少量雌性陰道分泌物制成涂片，硫堇染色，通過顯微鏡觀察確定個體是否進入動情期。若陰道涂片中大多數(shù)細胞為無核角化細胞或存在少量上皮細胞，則認為個體處于動情期，反之，則未進入動情期（He & Tai，2009；Meek et al，2006）。僅選擇處于動情期的雌性作為刺激鼠。雌、雄性刺激鼠被放置于不同的鼠箱，且實驗動物實驗前從未接觸過刺激鼠的任何氣味。每個實驗動物均設(shè)置相對應(yīng)的刺激鼠，即刺激鼠無重復(fù)使用。

表1 雌性親代和雄性子代的藥物注射分組Table 1 Grouping of female parents and male of fspring under treatments

1.4 行為觀察

性取向?qū)嶒炑b置為一個三室的”Y”字形有機玻璃裝置，各室（30 cm×61 cm×41 cm）內(nèi)壁均設(shè)置開口，允許實驗鼠在三室間自由活動。雌、雄性刺激鼠分別置于兩個外室，中間室不設(shè)置刺激動物。用線繩在刺激鼠頸部打結(jié)，并將其活動限制于外室，以防止刺激鼠主動接近實驗鼠或相互接近。將實驗鼠放入中間室適應(yīng)5 min，于08：00—10：00進行行為測試。

實驗鼠的性取向?qū)嶒炐袨榘l(fā)生過程（20 min）被數(shù)碼相機（Panasonic NV-GS15EG）記錄，包括接近、嗅聞、抱團、脊柱前彎、爬胯與交配等性取向行為及性行為，同時，包括靜止、看、爬墻、移動及咬繩子等非社會行為。用 Noldus Observe 9.0（Noldus Information Tech nology，Wageningen，Netherlands）分析行為持續(xù)時間。

各實驗鼠測試完成后，用肥皂、水及70%乙醇洗滌整個實驗裝置。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用配對t-檢驗（paired t test）檢測同一小組內(nèi)實驗雄鼠在“Y”字形裝置中的性取向行為和性行為數(shù)據(jù)，用單因素（one-way factorial analysis of variance）和Post Hoc 檢驗（Post Hoc tests）分析不同處理小組之間各種行為的差異性。所有數(shù)據(jù)用mean±SE表示，P＜0.05為顯著性差異。統(tǒng)計分析采用SPSS10.0（SPSS Inc.，Chicago，USA）。

2 結(jié)果

2.1 圍產(chǎn)期藥物對雄性鼠性取向行為的影響

注射藥物 3 d（t9=2.562，P=0.027）、6 d（t9=2.661，P=0.025）、9 d（t9=2.862，P=0.021）和 14 d（t9=4.862，P=0.001）雄鼠的性取向選擇行為顯示，對照組取向雌、雄的時間不同，但都明顯取向雌性。其他兩組雄鼠的性取向在注射藥物 3 d（clomiphene：t9=1.490，P=0.174；Estradiol：t9=1.612，P=0.115）和 6 d（clomiphene：t9=1.590，P=0.164；Estradiol：t9=1.722，P=0.095）時無明顯差異，注射克羅米酚9 d（t9=2.933，P=0.012）及 14 d（t9=3.936，P=0.008）的雄鼠均明顯取向雄鼠，而注射雌二醇 9 d（t9=2.543，P=0.031）和 14 d（t9=4.377，P=0.007）的 雄鼠則明顯取向雌鼠。

注射藥物3 d和6 d，三組動物在性取向雌（3 d：F（2,27）=1.554，P=0.083；6 d：F（2,27）=1.704，P=0.072）、雄（3 d：F（2,27）=1.354，P=0.091；6 d：F（2,27）=1.854，P=0.066）及非社會行為（3 d：F（2,27）=1.654，P=0.073；6 d：F（2,27）=1.774，P=0.069）等方面均無明顯差異（圖1）。

圖1 分別注射藥物3、6、9、14 d的雄鼠行為Figure 1 Behavior of male mice under 3，6，9，14 days’ drug treatment

與對照組相比，注射9 d和14 d克羅米酚的雄鼠取向雌鼠的時間明顯減少（9 d：F（2,27）=4.245，P=0.008；14 d：F（2,27）=5.245，P=0.001），取向雄鼠的時間明顯增多（9 d：F（2,27）=3.245，P=0.032；14 d：F（2,27）=3.045，P=0.043），而注射 9 d和 14 d雌二醇的雄鼠取向雌（9 d：P=0.124；14 d：P=0.064）或雄鼠（9 d：P=0.087；14 d：P=0.107）的時間與對照組之間均無顯著性差異，且注射克羅米酚雄鼠（9 d：P=0.005；14 d：P=0.035）和注射雌二醇（9 d：P=0.045；14 d：P=0.015）雄鼠的非社會行為均明顯多于對照組（圖1）。

2.2 閹割對性取向行為的影響

閹割后，假手術(shù)組明顯性取向雌性（t9=3.852，P=0.009），而閹割后的雄性鼠雖然對雌鼠的性取向明顯減少（F（1,18）=3.983，P=0.011），但其對雌、雄的性取向仍不明顯（t9=1.852，P=0.072），且非社會行為明顯增多（F（1,18）=3.083，P=0.042）（圖 2）。

圖2 閹割后的雄鼠行為Figure 2 Behavior of the castrated male mice

3 討論

3.1 圍產(chǎn)期雌激素阻斷劑處理改變雄性小鼠性取向

以上各組動物的行為顯示，早期雌激素拮抗劑——克羅米酚處理后，成年雄性動物性取向于雄性刺激鼠。與對照組相比，產(chǎn)后注射克羅米酚3 d及6 d時，雄鼠性取向于雄鼠的行為增多，到第9天出現(xiàn)明顯差異，到第 14天出現(xiàn)極顯著性差異?？梢?，圍產(chǎn)期雌激素拮抗劑不僅影響成年雄鼠的性取向行為，且該影響隨天數(shù)的增多而增大。雌激素拮抗劑及雌激素與ERα競爭性結(jié)合，影響雄性化大腦結(jié)構(gòu)的形成并形成雌性化的大腦（Cushing et al，2008），進而影響個體成年后的性取向行為。圍產(chǎn)期克羅米酚處理、腦區(qū)ERα數(shù)量減少以及個體成年后出現(xiàn)的同性取向行為之間的聯(lián)系是我們今后的研究內(nèi)容。

雖然，圍產(chǎn)期（產(chǎn)前7 d和產(chǎn)后7 d）是影響個體大腦發(fā)育的關(guān)鍵時期，但在我們的實驗中產(chǎn)前3 d到產(chǎn)后的6 d注射雌激素拮抗劑已對成年雄鼠的性取向造成了影響，表明在這9 d中激素的作用已影響了腦結(jié)構(gòu)的發(fā)育，并進而影響成年個體的行為。由此，我們推斷激素影響大腦的發(fā)育由雄性化到雌性化是逐步形成的，是量變到質(zhì)變的過程。因此，具有雄性性取向和雌性化性行為的雄性個體與早期暴露于低濃度的性激素水平有關(guān)。這一研究結(jié)果也與其他研究者的結(jié)果一致，圍產(chǎn)期腦內(nèi)雌激素較少的雄性大鼠產(chǎn)生雌性化的大腦結(jié)構(gòu)，使成年期的雄鼠產(chǎn)生雌性化行為，即容易導(dǎo)致成年期的雄鼠產(chǎn)生性取向雄鼠的行為（Cohen-Bendahan et al，2005）。

在腦的發(fā)育過程中，雌激素?zé)o疑能效仿雄激素的某些作用，并影響促性腺激素的周期性分泌和性行為等。對出生后幾天的雌性大鼠幼體注射雌激素，當(dāng)其成年時，促性腺激素的周期性分泌將受到抑制，并喪失周期性卵巢活動，同時，雌激素對促性腺激素分泌應(yīng)有的正反饋性刺激作用也將消失（Garzo et al，1988），即性行為不但去雌而且雄性化。性激素通過兩種方式作用于腦神經(jīng)元：（1）間接作用，即通過與腦內(nèi)特定部位的細胞內(nèi)受體相結(jié)合形成復(fù)合物，經(jīng)核轉(zhuǎn)位，與基因上特異的激素反應(yīng)元件結(jié)合，影響特定基因表達及蛋白質(zhì)合成；（2）直接作用，即通過改變某些腦區(qū)神經(jīng)元的膜通透性，影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、攝取、滅活、合成以及突觸后膜受體的敏感性，性激素與多種神經(jīng)遞質(zhì)之間相互作用，形成特殊的神經(jīng)內(nèi)分泌效應(yīng)，從而影響腦的性分化及個體的性取向（McCarthy & Arnold，2011）。另外，大腦發(fā)育的關(guān)鍵時期是圍產(chǎn)期，是否僅產(chǎn)前克羅米酚處理，即可改變成年個體的性取向行為，這是我們下一步需要進一步驗證的。

與對照組相比，注射雌二醇3 d的雄鼠性取向于雌鼠略微增多，注射6、9、14 d的雄鼠性取向于雌鼠略微減少，而注射3、6、9 d的雄鼠性取向于雄鼠略微增多，注射14 d的雄鼠性取向于雄鼠略微減少。由此可見，圍產(chǎn)期雄鼠的外來雌激素水平上升與個體成年后的性取向無緊密聯(lián)系，并不能使得雄鼠更加雄性化或增加其雌性化行為，而個體性取向略傾向于雌性或雄性可能僅為個體差異。早期雌激素暴露對雄性大腦發(fā)育的影響，并不影響成年個體的性取向行為，表明超過生理水平的雌激素并不能使得雄性更加取向雌性或提高雄性的性行為，而可能反而起到相反的作用。研究發(fā)現(xiàn)，雌激素處理后的新生個體，其成年時睪丸產(chǎn)生的睪酮減少（Delbès et al，2007）。這可能是由于早期雌激素暴露將直接抑制有關(guān)酶的產(chǎn)生，從而抑制睪酮的產(chǎn)生（Goyal et al，2003；2004），并進而影響雄性化的性行為（Sakuma，2008）。

圍產(chǎn)期注射雌激素或雌激素拮抗劑所引起的體內(nèi)激素水平或功能異常均可影響雄鼠的非社會行為。與對照組相比，注射藥物第3天、第6天時，雄鼠的非社會行為無明顯變化，第9天、第14天時，非社會行為顯著增多。這可能是由于藥物作用時間過長，動物個體之間的交流減少等，目前還不明確。

3.2 閹割對個體性行為的影響

行為實驗中，假手術(shù)雄性小鼠明顯性取向雌性，而青春期（生育后21 d）閹割小鼠成年后的性取向無明顯差異，這可能與閹割后激素未影響大腦發(fā)育有關(guān)。激素對人和動物的影響表現(xiàn)在組織結(jié)構(gòu)及活性作用兩方面。對組織結(jié)構(gòu)的影響很可能發(fā)生在大多數(shù)神經(jīng)結(jié)構(gòu)建立時的早期發(fā)育中，即圍產(chǎn)期，對腦的神經(jīng)環(huán)路和敏感性將產(chǎn)生永久影響。青春期大腦結(jié)構(gòu)進一步發(fā)育完善，成年后，青春期激素和大腦的相互作用將影響個體對社會刺激的神經(jīng)反應(yīng)及其社會行為的表達（Sisk & Zehr，2005；Cohen-Bendahan et al，2005）。對活性作用的影響伴隨循環(huán)水平激素的變化而變化，雄激素增加雄性化行為，雌激素增加雌性化行為（He & Tai，2009）。青春期前、后被閹割的雄性倉鼠，六個星期后，經(jīng)過長達17 d的睪酮處理后暴露于三個雌性個體，青春期前被閹割雄性的爬跨、插入和射精行為等明顯少于青春期后閹割的雄性。因此，青春期的大腦發(fā)育期間若缺乏性激素，即使在成年后用雄激素處理，個體仍不能顯示雄性化的行為。相反，青春期的大腦發(fā)育期間的性激素刺激可提高成年時期雄激素誘導(dǎo)的生殖行為，即提高雄性化行為（Sisk &Zehr，2005）。除與性行為的關(guān)系外，青春期前暴露于性激素也會影響個體的性取向。Vega Matuszczyk et al（1997）發(fā)現(xiàn)，出生后第10天被閹割的雄性大鼠在成年后將缺乏對雌性伙伴的偏好。Brand & Slob（1988）發(fā)現(xiàn)，在 21日齡被閹割的雄性大鼠，即使于成年時期用雄激素處理，仍不能沒有影響其性取向。本實驗于生育后21 d閹割雄性大鼠，個體成年后既不明顯取向雄性，亦不明顯取向雌性，這可能與個體成年后未使用激素處理有關(guān)。循環(huán)激素水平可提高探究行為的動力，即提高性動機（Bonilla-Jaime et al，2006；Nyby，2008），若缺乏性動機，即可能出現(xiàn)以上現(xiàn)象。本實驗中，閹割后的雄性大鼠的非社會行為較假手術(shù)鼠明顯延長，該現(xiàn)象的可能原因是由于閹割導(dǎo)致個體體內(nèi)激素水平下降，進而導(dǎo)致社會行為動機減少（He & Tai，2009）。

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