β－桐酸誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞凋亡機(jī)理

謝 煜 萍，王 晗，孫 仲 琰，葉 淑 紅，李 倩，王 際 輝

(大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 大連 116034)

0 引 言

多年以來，人們致力于尋找高效低毒的抗癌藥物，天然產(chǎn)物共軛亞麻酸由于其多種保健功效成為熱點(diǎn)之一。近年來的研究發(fā)現(xiàn)其能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，可能的機(jī)制包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，改變信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑。

β－桐酸(t9，t11，t13－CLnA)是共軛亞麻酸的一種常見異構(gòu)體，主要存在于桐油及苦瓜籽油中。近年來報(bào)道稱共軛亞麻酸具有抑制腫瘤形成、提高免疫力、影響脂類代謝和減肥等多種保健功效[1－3]，且研究證明全反式的共軛雙鍵結(jié)構(gòu)如β－桐酸、β－金盞花酸較非全反式的α－桐酸、α－金盞花酸具有更強(qiáng)的抗癌及促凋亡功效[4]。研究發(fā)現(xiàn)，β－桐酸對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，但是其具體作用機(jī)理尚且不清楚。因此本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平上研究了β－桐酸對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞的凋亡率的影響，以及與凋亡相關(guān)蛋白的變化情況，從而探索其凋亡誘導(dǎo)機(jī)制。對(duì)開發(fā)我國(guó)天然共軛亞麻酸資源，提高天然共軛亞麻酸資源附加值，發(fā)現(xiàn)潛在膀胱癌的藥物原料，有著重要的理論和實(shí)際意義。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑

人膀胱癌T24細(xì)胞，中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫；β－桐酸，瑞典 Larodan Fine Chemicals AB；RPMI－1640細(xì)胞培養(yǎng)液，美國(guó)Sigma公司；胎牛血清，美國(guó) HyClone公 司；Hoechst 33342、Annexin V／PI凋亡檢測(cè)試劑盒，杭州碧云天生物技術(shù)研究所；MTT，美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CO2恒溫培養(yǎng)箱，MCO－17A，日本三洋電機(jī)株式會(huì)社；超低溫恒溫冰箱，NU－6382，日本三洋電機(jī)株式會(huì)社；流式細(xì)胞儀，Cell Lab Quanta SC，美國(guó)貝克曼公司；倒置熒光顯微，AE30／31，廈門Motic公司；酶標(biāo)儀，TECAN SUNRISE，奧地利TECAN公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1 Hoechst33342熒光染色結(jié)果

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膀胱癌T24細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，以含有10% 胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。加入不同濃度的β－桐酸，繼續(xù)培養(yǎng)24h，棄去原培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，加入含5μg／mL的Hoechst 33342的培養(yǎng)液，于37℃下孵育10min。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞被標(biāo)記情況，用紫外光激發(fā)，最大激發(fā)波長(zhǎng)為346nm，發(fā)出藍(lán)色熒光，發(fā)射波長(zhǎng)為460nm。

1.3.2 流式細(xì)胞檢測(cè)

取對(duì)數(shù)期膀胱癌T24細(xì)胞接種于6孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。加入不同濃度的β－桐酸，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。用PBS將懸浮細(xì)胞洗滌2次，用500μL的Annexin V Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5μL Annexin V－FITC混勻后，再加入5μL PI，混勻，避光室溫反應(yīng)10min后，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，定量反映細(xì)胞凋亡率。

1.3.3 Western Blot實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)期膀胱癌T24細(xì)胞接種于6孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。取出6孔板，棄舊培養(yǎng)液，加入一定濃度的β－桐酸和T0070907，每種濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h。用PBS洗滌后，在冰上向每個(gè)孔內(nèi)加入100μL細(xì)胞裂解液，然后迅速刮取蛋白，并離心煮沸分裝待用。蛋白被SDS－PAGE分離后，將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)膜、封閉，孵育一抗，用PBST洗去非特異性結(jié)合一抗；之后孵二抗，再用PBST洗掉未結(jié)合的二抗，隨后與ECL顯色液A、B的混合液相混，經(jīng)不同曝光時(shí)間使膠片感光，最后膠片在定影顯影液中顯色用于分析。

1.3.4 細(xì)胞活力測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用MTT法來測(cè)定癌細(xì)胞的相對(duì)活力，將處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的膀胱癌T24細(xì)胞接種于96孔板上，接種濃度為103個(gè)／孔，培養(yǎng)過夜，分別向每孔中加入不同濃度的β－桐酸及PPARγ抑制劑T0070907，作用24h后，除去培養(yǎng)液，向每孔加 MTT(0.5mg／mL)100μL，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清液，每孔加DMSO 150μL，振蕩，室溫放置10min。用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處檢測(cè)其吸光度。按公式計(jì)算細(xì)胞存活率，每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次：

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，采用Origin Pro7.5進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。以P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 β－桐酸對(duì)T24細(xì)胞形態(tài)的影響

熒光Hoechst 33342染料能特異性結(jié)合細(xì)胞內(nèi)DNA，如圖1A所示，正常細(xì)胞核呈彌散均勻熒光，核膜規(guī)整呈圓形，熒光較弱。由圖1B～D可以發(fā)現(xiàn)，β－桐酸作用濃度20μmol／L時(shí)，細(xì)胞體積變小，熒光加強(qiáng)，出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象；而濃度增至40μmol／L時(shí)，細(xì)胞核碎裂，染色增強(qiáng)，呈濃染致密的顆粒塊狀強(qiáng)熒光，凋亡現(xiàn)象顯著[5]。結(jié)果表明，β－桐酸可以誘導(dǎo)T24細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖1 β－桐酸處理后T24細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 Morphology observation of T24cells treated withβ－eleostearic acid

2.2 β－桐酸對(duì)T24細(xì)胞凋亡率的影響

當(dāng)不同濃度的β－桐酸(10、20、40μmol／L)分別作用T24細(xì)胞24h后，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T24細(xì)胞凋亡率顯示，對(duì)照組凋亡率不足5%，而隨著β－桐酸濃度增加，細(xì)胞凋亡率顯著升高。當(dāng)β－桐酸的濃度為20μmol／L時(shí)，細(xì)胞的凋亡率約為50%左右，與對(duì)照組相比有顯著性差異。當(dāng)濃度達(dá)到40μmol／L時(shí)，T24細(xì)胞的凋亡率達(dá)到78%左右，極大地抑制了細(xì)胞活力[6]。這與MTT所得結(jié)果相吻合，β－桐酸對(duì)T24細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用可能是通過誘導(dǎo)其凋亡來實(shí)現(xiàn)的。

圖2 β－桐酸對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect ofβ－eleostearic acid on T24cell apoptosis

2.3 β－桐酸對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Caspase－3作為終端執(zhí)行者在各種刺激信號(hào)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)揮著重要作用，其表達(dá)量的上調(diào)被看做是凋亡的重要表現(xiàn)之一[7]，而Bcl－2是一種能抑制細(xì)胞凋亡原癌基因，可以通過抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C來抑制細(xì)胞凋亡，許多腫瘤中Bcl－2表達(dá)均增高[8]。圖3為蛋白免疫印跡法檢測(cè)β－桐酸對(duì)T24中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。由圖3發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入β－桐酸后，Caspase－3的表達(dá)量上調(diào)，同時(shí)Bcl－2的表達(dá)量降低，提示β－桐酸誘導(dǎo)了T24細(xì)胞凋亡，且可能是通過線粒體途經(jīng)來完成的。

2.4 PPARγ在β－桐酸誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡中的作用

過氧化物酶體增殖物激活性受體(PPARs)屬于家族核酸受體[9]。它們是轉(zhuǎn)錄因子，具有調(diào)節(jié)與脂質(zhì)代謝的基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)的功能。圖3顯示β－桐酸處理后，PPARγ的表達(dá)呈上升趨勢(shì)。

圖3 β－桐酸對(duì)T24中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect ofβ－ESA on Caspase－3，Bcl－2，PPARγ protein expression

MTT法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)活力，結(jié)果如圖4所示，與對(duì)照組相比，單獨(dú)加入TT0070907時(shí)，對(duì)細(xì)胞的活力并無影響。當(dāng)加入的β－桐酸時(shí)，能顯著降低細(xì)胞活力，而當(dāng)加入PPARγ抑制劑T0070907后，大幅提高了細(xì)胞存活率。這與之前的Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果相結(jié)合，顯示β－桐酸可能通過激活細(xì)胞內(nèi)PPARγ導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)作用。

圖4 β－桐酸和抑制劑T0070907對(duì)細(xì)胞相對(duì)活力的影響Fig.4 Effect ofβ－eleostearic acid and T0070907on T24cell vitality

為了進(jìn)一步研究β－桐酸的凋亡誘導(dǎo)機(jī)制，細(xì)胞培養(yǎng)液中加入PPARγ抑制劑T0070907后測(cè)T24細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的活性，結(jié)果如圖5所示。隨著β－桐酸的加入，細(xì)胞內(nèi)PPARγ蛋白表達(dá)量升高，并且Bax／Bcl－2的比值也增大。當(dāng)加入PPARγ蛋白的抑制劑T0070907后，與未加抑制劑的對(duì)照相比PPARγ被顯著抑制了活性，且Bax水平下降，而Bcl－2水平上升了，由此推斷，PPARγ可能參與β－桐酸誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡的機(jī)制中。

圖5 β－桐酸及PPARγ抑制劑 T0070907對(duì)T24中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect ofβ－ESA and PPARγinhibitor T0070907 on apoptotic protein expression

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過Hoechst33342熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)為β－桐酸能誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞凋亡提供了有力的證據(jù)，且通過蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示β－桐酸處理T24細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白 Caspase－3、Bax／Bcl－2的比值和 PPARγ均上調(diào)。加入PPARγ抑制劑T0070907后檢測(cè)細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)其能拮抗β－桐酸的作用，顯示β－桐酸對(duì)T24細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用可能是通過PPARγ的激活介導(dǎo)的。

本實(shí)驗(yàn)為以后其他研究者更深入地研究β－桐酸的抗癌作用機(jī)理提供了思路，也為功能性的共軛亞麻酸(CLnA)作為膳食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑或者潛在抗癌臨床藥物或輔助藥物提供理論依據(jù)。

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